利用双光子显微镜在斑马鱼幼体中进行靶向神经元消融

从一只已麻醉并固定在琼脂糖中的转基因斑马鱼幼鱼开始，将其置于含有麻醉溶液的培养皿中。

将其置于双光子激光显微镜下，该显微镜利用两个光子进行高分辨率成像。

重点关注大脑的顶层和底层，以确定成像边界。

在激光处理前，于不同深度采集图像以观察神经元。

调整焦点至目标区域，并调节帧大小以进一步聚焦于神经元。

使用双光子激光选择并照射神经元。

激光会诱导局部加热，导致神经元死亡，同时对周围组织的损伤最小。采集图像。

比较治疗前和治疗后的图像，以评估荧光变化。

重新聚焦到更深层的神经元平面，并重复照射，以处理感兴趣区域内的所有神经元。

重新捕获图像，并将其与处理前的图像进行比较。激光处理后荧光的消失证实了神经元消融的成功。

将含有幼虫的琼脂糖凝胶置于双光子激光扫描显微镜下，并启动显微镜系统。打开图像采集软件，在“Laser”选项卡下，单击“on”按钮以开启激光器。等待激光器状态从“Busy”变为“Mode Locked”。

在通道选项卡中，将激光波长设置为 880 纳米以进行 EGFP 消融，或设置为 800 纳米以进行 GcAMP 消融。通过手动旋转物镜转盘选择 20 倍物镜。然后，点击定位选项卡。点击 GFP 以切换光路，通过目镜直接观察荧光。将斑马鱼幼体脑部置于视野中央。随后，点击采集选项卡返回双光子显微镜，并设置激光功率和增益。

作为消融前状态的记录，单击“Z-Stack”以选择Z-Stack选项。然后，将焦点对准幼虫脑腹侧末端，单击“Set First”按钮以设定下限；再将焦点对准脑背侧最表面，单击“Set Last”按钮以设定上限。最后，单击“Start experiment”按钮以开始Z-Stack图像采集。

接下来，通过手动转动物镜转换器选择 63 倍物镜。然后，点击“Locate”选项卡切换至落射荧光显微镜模式，用肉眼将待消融的细胞移至视野中央。随后，点击“Acquisition”选项卡返回激光扫描显微镜模式。

在“采集模式”选项卡中，将帧大小设置为 256 × 256。点击“实时”并观察目标神经元。然后，从最背侧开始，找到一个使待消融细胞处于清晰焦平面的位置。使用“区域”功能，在每个神经元上标记一个直径约为细胞大小三分之一的圆形区域作为感兴趣区域（ROI）。

将扫描速度设置为每 256 × 256 像素 13.93 秒，对应激光在每个像素上的停留时间约为每像素 200 微秒，或每半微米 200 微秒。同时，将迭代周期设置为 4 次重复。点击“开始实验”以执行时间序列和漂白功能。比较消融前与消融后时间序列周期中的图像，以确保靶向细胞中的荧光已消失。

接下来，将焦平面略微调深，选择下一个未消融细胞出现的焦平面。执行如上所述的漂白功能，并重复此过程，直至目标神经结构中的所有细胞均已被消融。消融后，检查细胞的荧光是否已完全消失，必要时重复激光照射。