基于短杆菌肽的荧光检测法；用于测定小分子改变脂双层性质的潜力

本实验的总体目标是测量药物诱导的双分子层特性变化，这些变化由跨双分子层蛋白感知。首先制备负载荧光染料的大型单侧囊泡，以实现这一目标。实验的第二步是用短杆菌肽对囊泡进行掺杂。

该实验步骤的第三步是加入外部淬灭剂，并测量内部荧光基团的淬灭速率。第四步是通过将拉伸指数函数拟合到荧光时间过程，定量分析每克活性中荧光淬灭的变化。最终，可获得结果以评估amfi蛋白是否能够改变脂双层的性质。

您好，我是 Ola Anderson。您好，我是 Helson。嗨，我是 Richie Kapo。

我是来自康奈尔大学威尔医学学院生理学与生物物理学系奥拉夫·安德森博士实验室的 Leah Sanford。今天我们将向您展示一种用于测量脂质双分子层性质变化的实验方法。在我们的实验室中，利用该方法研究药物和小分子对脂质双层性质的影响。

首先，让我们开始实验操作。在实验第一天，从冷冻柜中取出脂质，使其平衡至室温。待其充分平衡后，向一个25毫升的圆底烧瓶中加入0.6毫升浓度为25毫克/毫升的脂质氯仿溶液。随后，在持续旋转烧瓶的同时，用氮气吹干溶液，直至所有氯仿完全蒸发。

一层薄薄的白色脂质膜覆盖烧瓶的整个下半部分，将脂质在真空干燥器中进一步干燥过夜。配制含有100毫摩尔/升硝酸钠、25毫摩尔/升 ANTS 和10毫摩尔/升 HEPES（pH为7）的溶液。调节该溶液pH时，避免使用任何含氯的溶液。

由于铊淬灭剂在第二天会与氯化物形成不溶性复合物，因此在1.67毫升电解质溶液中重新水化脂质，以获得10毫摩尔的脂质悬浮液。达到正确浓度后，用封口膜封住容器，充分涡旋混匀，并用铝箔包裹以避光，然后在室温下静置过夜老化。

第三天，在低功率超声仪中将混合物超声处理一分钟。然后进行冻融循环：先在干冰上放置五分钟，再放入温水中五分钟，重复此冻融循环四到五次。使用Avanti微型挤出器挤出脂质悬浮液。

使用0.1微米聚碳酸酯滤膜及滤膜支撑装置安装小型挤出器，将悬浮液来回挤出21次，直至几乎透明的悬浮液出现在对侧注射器中，从而制备得到大单层囊泡（LUV）悬浮液。通过已用钠缓冲液平衡过的PD-10脱盐柱去除外部ANTS，将挤出后的悬浮液过柱。向柱中加入1.5毫升LUV悬浮液和1毫升钠缓冲液。

当溶液完全进入层析柱后，用三毫升钠盐缓冲液洗脱脂质体，并收集洗脱液。所得的 A NTS 包封 LUV 原液应含有约 4 至 5 毫摩尔脂质，外观呈半透明、乳白色。

用铝箔避光保护溶液，并在使用前24小时于13摄氏度保存，使用前充分涡旋振荡。ANTs填充的LUV储备溶液。由于UUVs的密度大于1克/毫升和/或会发生沉降。

然后用钠缓冲液将装有 A NTS 的大单层囊泡（LUV）储备溶液稀释至 1:20。取四分之三的脂质体与 260 纳克溶于 DMSO 中的 abidin 孵育，向剩余的四分之一中加入等体积不含 gamin 的 DMSO。

为了使所有样品中的溶剂浓度保持恒定，将格拉明在13摄氏度下于脂质囊泡的内层和外层单分子层之间平衡24小时。此处使用配备温度控制的Applied Photophysics SX.20停流光谱荧光仪来测定荧光猝灭速率。开始前，提前一小时开启仪器，以确保仪器充分预热。

用于激发的狭缝应设置为1/1，记录发射时应使用55纳米的高通滤光片，并通过pro data SX软件进行。首先设置记录条件，将单色器的激发波长设为352纳米。使用压力保持设置。

将时间设置为1秒，采样点设置为5,000。缓冲液运行的重复次数调整为9次，淬灭剂运行的重复次数调整为13次。在Essex软件的检查驱动程序配置文件中监测温度。

驱动体积应设置为120微升，即从每支注射器中混合60微升，可获得约1.2毫秒的死时间。将荧光检测器的高压或增益调节至约420伏。

目标是获得约八个荧光读数，将先前制备的装载了 A NTS 的 UUVs 在 25 摄氏度避光条件下平衡 10 分钟。平衡完成后涡旋样品，然后将其装入左侧注射器。在右侧注射器中装入钠缓冲液或铊淬灭剂。

通过来回推动注射器排除任何气泡。两个注射器应等量装填。在关闭第一个样品的阀门之前，用钠缓冲液记录荧光信号。

重复四次，并根据需要调整增益。然后对剩余样品再重复五次。用钠缓冲液记录九次重复。

将钠缓冲液替换为铊淬灭剂，并记录13次重复。用水冲洗后，继续进行下一个样品的对照。包括不含生物碱的溶剂对照样品，以及不含生物碱但含有最高化合物浓度的样品。

在进行荧光检测时，同时使用格拉明和溶剂，并将数据读入 MATLAB 软件进行分析。对于每个样本，需读取所有缓冲液和淬灭剂的重复数据，其中前四次重复会受到管路中先前残留物质的污染。在此情况下，信号来源于前次清洗残留的水与钠缓冲液样本混合所产生的结果。

第五至第九次重复代表仅来自样品的信号，因此我们始终排除每组中的前四次重复。为避免混合伪影，需手动检查曲线轨迹，剔除任何异常的重复数据，例如因混合伪影或气泡导致出现尖峰或偏离的红色轨迹。

然后将每个样品在每种实验条件下淬灭剂重复组的数据归一化为缓冲液重复组的平均起始值，将所有样品的平均值合并到一张可视化图中；不含格拉明的样品应结果相似，并显示几乎无荧光淬灭。对于含格拉明的样品，由于铊离子缓慢进入囊泡，荧光信号会缓慢降低。如果该化合物明显改变了荧光时间进程，则表明该化合物在所测试浓度下改变了脂双层性质；接下来，对归一化荧光淬灭曲线的前2至100毫秒数据拟合一个拉伸指数函数。

对各个重复实验计算在两毫秒时的速率，然后根据各个重复实验计算给定样本的平均值和标准差。此处以 cap 表示的辣椒素对荧光淬灭时间过程的影响，在无或有以 ga 表示的格列胺存在条件下进行观察，归一化的荧光信号在此处显示为一秒内的变化。灰色圆点代表所有重复实验的结果，而红色线条代表平均值。

展示了归一化荧光信号的前100毫秒。灰色点表示每种条件下单次重复的实验结果。红色线条是对这些重复数据进行拉伸指数拟合的结果。

被抑制的蓝线表示两毫秒的时间点，即淬灭速率的测定时刻。通过将数据归一化到含有格拉明但无修饰剂的对照样品，来确定淬灭速率的相对变化。

当辣椒素结合到脂双层时，会改变脂双层的性质。脂双层变软的变化将反映为单体-二聚体平衡向有利于导电型二聚体的方向移动，表现为色氨酸侧的偏移。我们刚刚向您展示了一种用于测定小分子对脂双层扰动效应的实验方法。

进行此操作时，重要的是要记住，每次实验均需使用同一批次的囊泡，并设置适当的对照。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。