一种基于定量荧光显微镜的单个脂质体检测方法用于分析单个脂质体之间的组分不均一性

大多数脂质体研究依赖于一些基本技术，这些技术默认所有脂质体都是相同的。通过研究单个脂质体，可以观察到显著的非均一性。本文介绍的单脂质体技术使我们能够同时研究数百个脂质体，并检测其在大小和组成上的非均一性。

该方法可轻松调整用于在单个脂质体水平上研究其他体系，例如蛋白质与膜的相互作用。您所需的一切只是将待研究的化合物进行荧光标记。通过本视频，我们为研究人员提供了开展单脂质体研究的技术工具。

我们希望已经明确，该检测方法可轻松修改以研究其他多种科学问题。首先，在一个新的玻璃小瓶中混合制备好的脂质储备液：138 微升 POPC 和 120 微升胆固醇。然后分别加入两种荧光标记脂质各 500 微升，以及 50 微升 DSPE-PEG-生物素。

松开玻璃小瓶的瓶盖，将小瓶在液氮中速冻 1 至 2 分钟。将冻结的脂质混合物在冷冻干燥机中冻干过夜。次日早晨，向干燥的脂质中加入 1 毫升 200 毫摩尔的 D-山梨醇缓冲液。

将混合物加热至45摄氏度，并在磁力搅拌下持续至少一小时。随后，将小瓶浸入液氮中冷冻脂质悬浮液，直至悬浮液完全冻结。接着，将冻结的悬浮液浸入55摄氏度的水浴中，直至混合物完全解冻。

将混合物暴露于总共11次冻融循环中。随后，使用微型挤出装置，将脂质体悬浮液通过800纳米聚碳酸酯滤膜挤出一次。取1份200微升BSA与120微升BSA生物素混合。

向八孔玻片的每个孔中加入 300 微升混合液，在室温下孵育 20 分钟。将玻片轻轻倾斜，从每个孔的边缘吸去培养基。立即向每个孔中加入 300 微升 HEPES 缓冲液进行洗涤。

每个孔总共洗涤八次。每孔加入250微升链霉亲和素，室温孵育10分钟。重复上述八次洗涤步骤。

将载玻片置于显微镜上，调节显微镜操纵杆以聚焦到腔室表面。可通过玻璃缓冲液界面增强的激光反射信号作为指引，轻松完成聚焦。在微量离心管中加入10 µL含有20 µmol总脂质的稀释脂质体储备液。

将100微升缓冲液从样品室转移至微量离心管中，充分混匀后，再将110微升溶液转移回样品室。将样品室置于显微镜下，使用能够检测脂质体荧光团信号的基础显微镜设置，观察脂质体在表面的固定情况。显微镜的设置方法请参照论文中的描述。

为了对脂质体中的 DOPE ATTO488 和 DOPE ATTO655 荧光染料进行多通道成像，请依次成像各个通道，以避免交叉激发。例如，首先在 488 纳米波长激发，并采集 495 至 590 纳米波长范围内的发射光，获取第一张图像。

随后，更改设置，通过633纳米激发，但仅在660至710纳米范围内采集发射光信号，获取另一幅图像。进行分析。在图像菜单中选择颜色，使用通道合并功能将两个通道的图像合并为一幅复合图像。观察在两个不同通道中成像的脂质体是否表现出良好的共定位，或是否存在明显的漂移现象。

为了检测颗粒，打开插件菜单，选择 ComDet 并点击检测颗粒。在 ComDet 中，确认设置正确无误，然后点击确定。运行分析后，将弹出两个显示结果和摘要的窗口。结果表格包含两个通道之间的强度比值。

导出包含共定位数据的数据表结果。使用高斯函数拟合强度比直方图，并提取均值和标准差。均值和标准差可用于计算非均质程度。

制备一种已通过50纳米滤膜多次挤出的脂质体制剂。通过将荧光强度与动态光散射（DLS）的粒径数据进行比较，校准脂质体的尺寸。使用与之前相同的显微镜实验设置，对校准用脂质体进行成像。

绘制校准脂质体荧光强度的平方根强度直方图。使用对数正态分布拟合该直方图，并将校准脂质体的平均荧光强度提取为几何平均值。为确定平方根强度与脂质体尺寸之间的关系，将动态光散射测量获得的脂质体平均直径除以平方根强度的几何平均值，计算校正因子。

计算组成不均一性实验中脂质体的强度平方根值，并将这两个直径乘以校正因子进行转换。绘制组成不均一性脂质体的强度比值随直径变化的关系图，从而获得跨越约50纳米至800纳米粒径范围的脂质体群体中不均一性随脂质体尺寸变化的规律。在本实验方案中，将脂质体溶液加入样品腔后，立即可见衍射极限的强度斑点，表明脂质体已成功固定于表面。

建议固定足够数量的脂质体，以达到每帧300至400个脂质体的密度。密度过低会使数据分析更加耗时，而密度过高则难以区分单个脂质体。如果整个视野未能正确聚焦，可能是样品板发生倾斜。

此外，如果脂质体看起来较大且模糊，这表明腔室中的缓冲液可能已蒸发，表面已经干燥。强度比直方图通常显示围绕平均比值的高斯分布。如果观察到明显偏离高斯分布的情况，则表明存在检测灵敏度问题，提示部分信号较弱的脂质体子集已被排除。

在使用高斯函数对强度比直方图进行拟合后，0.23的不均一性程度值表明，有32%的群体其摩尔比与整体平均摩尔比的偏差超过23%。实验不确定性的量化结果为0.1。该检测的性能永远不会超过所用材料的品质，因此高质量的单层脂质体至关重要。

因此，在制备过程中，切勿偷工减料，例如省略冻融循环步骤。图像质量差会导致实验不确定性升高，并使您高估样品的不均一性，因此请务必花费足够时间获取清晰对焦的良好图像。该检测方法的基本原理是研究荧光标记物的表面密度。

如果该荧光标记位于一种渗透性脂质上，则该检测方法可用于药物递送用脂质体的质量检测。该实验体系已被应用于研究肽如何与膜结合并感知膜曲率，从而为研究人员提供了关于肽在细胞内分选过程所依赖的分子信号的独特见解。