膜转运蛋白MexB多药耐药蛋白的表达、去垢剂增溶及纯化

为了纯化 Mex B 膜蛋白，首先利用重组 DNA 技术在大肠杆菌（e coli）中表达 Mex B。然后分离膜组分，并使用温和型去垢剂溶解膜蛋白。溶解后的膜蛋白通过 iMac 进行纯化，随后再通过凝胶过滤色谱法进一步纯化该蛋白。

通过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳来确定蛋白质的纯化程度。尽管该方法可用于研究多药耐药性跨膜转运蛋白，但也适用于其他膜蛋白。今天演示的实验流程将由我实验室的一名研究生完成。在本实验中，将铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的 MexB 基因亚克隆至 PET-30b(+) 表达载体中，使 MexB 以带有 C 末端六聚组氨酸标签的形式表达。实验从傍晚开始：接种四管含卡那霉素的 3 毫升 LB 培养基，使用新鲜转化子或冻存菌种，在 37°C 条件下置于摇床中过夜培养。

使用过夜培养物接种含有 30 微克/毫升的 150 毫升 LB 培养基。下午能否在 37 摄氏度摇床条件下培养含有 30 微克/毫升的 Mycin 培养物？用小量培养物接种六份各一升的 XYT 培养基，每份均含有 30 微克/毫升。

蕨类植物的三角瓶中能否使用制霉菌素？每种培养物使用25毫升，进行1:40稀释。在37°C下培养，直至达到光密度。

当菌液密度达到 0.4 到 0.6 时，约需 1.5 小时。当培养物达到合适密度后，加入 0.5 毫升 1 摩尔的 IPTG 以诱导蛋白表达。将所有锥形瓶放回摇床，继续在 30 摄氏度下培养过夜，直至次日早晨收获细菌。

从摇床中取出培养物并进行冷却。然后，为收获细胞，将培养物转移至离心管中，在大型离心机中于 4 摄氏度、5,000 转/分钟的条件下离心 30 分钟，同时对细胞进行离心处理。向 100 毫升细胞重悬缓冲液中添加 DNA 酶、蛋白酶抑制剂和溶菌酶。

同时，根据本表所示，向两份膜重悬缓冲液中添加蛋白酶抑制剂。离心完成后，将所有三种溶液置于冰上。用100毫升细胞重悬缓冲液重悬细胞沉淀。

接下来，进行细胞提取。将细胞悬液装入法国压榨细胞装置中，并将该装置置于法国压榨机上。施加压力直至达到每平方英寸12,000磅。

将阀门打开极小的幅度，使破碎的细胞缓慢滴出。切勿将阀门开得过大而导致细胞喷出，否则细胞释放时压力不足，无法有效破碎。用瓶子收集细胞裂解液，并将瓶子置于冰上保持低温。

将细胞溶液再次通过法国压力细胞，压力为12,000磅/平方英寸。将细胞裂解液转移至SS 34离心管中，在4°C下使用SS 34转子以10,000转/分钟离心30分钟，以去除细胞碎片。接下来为澄清的裂解液。

用于制备膜组分。小心将上清液转移至 TI-647 0.5 超速离心管中，在 4 °C 条件下，使用 TI-647 0.5 转子以 40,000 转/分钟离心 50 分钟。

弃去上清液。用移液器将含有细胞膜的沉淀物轻轻重悬于约25毫升膜重悬缓冲液中，将膜悬液转移至洁净的离心管中，在TI I 6 4 7 0.5转子中于4°C、40,000转/分钟条件下离心50分钟，然后将洗涤后的膜沉淀物重新悬浮于25毫升膜重悬缓冲液中。接下来，向约25毫升重悬的膜中加入试剂以溶解膜蛋白。

加入6 mL的10% DDM，使最终去垢剂浓度为2% DDM，在4°C下轻轻摇动混合物2小时。在DDM存在下孵育2小时后，将混合物于TI I 6 4 7 0.5转子中，在4°C下以40,000转/分钟离心40分钟，以分离可溶性蛋白-去垢剂复合物与不溶性蛋白。收集含有Mex B蛋白-去垢剂复合物的上清液，用于后续纯化。将含有Mex B蛋白-去垢剂复合物的上清液与2 mL已用Resus悬浮缓冲液平衡的金属螯合亲和树脂珠混合，在4°C下于旋转仪上孵育1小时，使蛋白与树脂结合。

将悬浊液倒入重力流层析柱中，弃去流出液。当柱子洗涤完成后，用20毫升或10个柱体积的iMac结合与洗涤缓冲液洗涤柱子。用10毫升iMac洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白质。

取每份洗脱组分10 µL样品，与10 µL两倍浓度的SDS上样缓冲液混合，然后在10%聚丙烯酰胺SDS凝胶上进行分析。

估算每种组分中 Mex B 的含量和纯度。收集含有 Mex B 蛋白-去垢剂复合物的组分，并在 4 摄氏度下使用离心浓缩器进行浓缩。注意在此步骤中防止蛋白质发生沉淀。

进行数次短时离心，并观察沉淀情况。每次离心后，继续使用凝胶过滤柱纯化合并的组分。用24毫升洗脱缓冲液预先平衡Super Rose 12 HL 30/10柱，等待基线平稳。

接下来，用流动缓冲液冲洗自动进样系统加载回路。在将蛋白质上样到色谱柱之前，使用注射器滤器过滤蛋白质溶液。然后，将最多 240 微升、浓度不超过每毫升 5 毫克的蛋白质溶液上样至色谱柱中。

用1.5倍柱体积的缓冲液进行洗脱，并收集0.25毫升的组分。XB蛋白-去垢剂复合物在洗脱体积约为10至15毫升时以峰的形式流出。取峰组分的5微升样品。

将每个样品与两倍SDS上样缓冲液按1:1比例混合。使用10%聚丙烯酰胺凝胶分析各组分中的ME Mex B蛋白含量及纯度，并收集含有纯ME B的组分。该聚丙烯酰胺凝胶中加样了iMac柱收集的组分以及凝胶过滤柱的各个组分。经过凝胶过滤柱纯化后，蛋白质在考马斯亮蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶上显示为单一纯蛋白条带。

凝胶过滤柱的图谱显示了蛋白质-去垢剂复合物从柱中洗脱的主要峰。每六升二倍XYT培养液中，mxb蛋白的平均产量约为两毫克。一旦掌握，若操作得当，该实验流程可在八小时内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何表达、溶解并纯化膜蛋白。