使用封闭式颅窗对小鼠脑微循环进行活体显微成像

本实验的总体目标是通过活体显微成像技术研究小鼠大脑的微循环，该技术可长期追踪软脑膜微循环中血流动力学和炎症标志物的动态变化。该技术由拉霍亚生物工程研究所开发，并已应用于多种类型的研究。例如，可用于随访伯氏疟原虫感染过程中血流动力学的变化，以及脑型疟疾发作时的相关研究。

首先，在活体显微镜研究前两周植入慢性颅窗，以实现这一目标。该操作的第二步是使用低倍率下的高分辨率数字图像记录颅窗的整体形态。第三步是通过常规照明和荧光照明获取活体显微镜图像，并选择特定的研究位点，用于在线测量血管直径和红细胞速度。

该实验步骤的最后一步是通过荧光标记的特异性抗体，对微血管中的白细胞和血小板黏附情况进行活体分析。最终可获得结果，通过脑部活体显微成像，在模拟生理、病理生理或疾病状态的脑模型中，实时展示体内微循环的变化，从而确立与这些状态相关的血流动力学改变。该技术的主要优势在于，我们能够在脑组织的生理环境中对其进行观察，而无需将其暴露于外部试剂或人工介质中。与磁共振成像和血管造影相比，活体显微成像具有更高的空间和时间分辨率，使我们能够从宏观到微观层面进行观察。

该方法有助于解答脑微循环生理学与病理生理学中的关键问题，例如在急性和慢性疾病期间的血流动力学变化和炎症反应。在进行活体显微镜检查前两到三周，对八至十周龄的小鼠实施开颅手术，操作步骤如前所述，但不将钛棒植入动物头部。慢性颅窗是一种稳定的制备方法，可在植入后数月内持续用于观察软脑膜微循环。

首先，在将小鼠放入立体定位仪之前，检测其体温，并通过小鼠尾静脉注入先前制备好的荧光标记红细胞。这将实现红细胞追踪，后续将对此进行演示。然后用异氟烷对小鼠进行轻度麻醉。

诱导使用4%，维持使用1%至2%。接下来，将动物置于恒温垫上的立体定位仪中，呈俯卧位。使用耳杆小心固定头部，并通过左右杠杆调整水平。

用浸有矿物油的棉签轻轻清洁颅窗上的盖玻片。然后使用连接数码相机的体视显微镜，拍摄几幅颅窗下血管的全景照片。将全景照片传输至计算机后，选择其中最佳的一张进行打印、标识并注明日期。

此照片将用作测量血管直径和红细胞流速的参考图，接下来将通过活体显微镜进行演示。将小鼠转移至定制的活体显微镜载物台上。利用牙科丙烯酸树脂形成的凹槽，在颅窗上滴加一滴水。

使用数值孔径为 0.5 的 20 倍水浸物镜。图像通过两台相机记录：一台数字低照度高速相机连接至计算机和显示器，另一台低照度模拟相机连接至录像带、时间戳记设备和彩色显示器。在选择待测血管之前，应先检查血管以评估制备质量，并确认所有血管中均有血液流动，然后选择待测血管。所选血管应包括不同直径的静脉和动脉，并覆盖窗体暴露区域内不同位置的血管。

在本实验中，我们在观察颅窗内的不同视野时，选取12条血管进行测量。为选取血管，需在先前拍摄的PY血管系统照片上标注每个待测点的精确位置；针对每个点，使用图像剪切装置测量血管直径。选定测量点后，将血管图像调整至垂直位置，并对图像进行剪切，直至两侧边缘对齐。

对极值进行对齐并记录读数。对于红细胞追踪，每个位点由数码相机至少记录30秒，视频图像以每秒150帧的速率进行采集。该速率设定为在单个视频帧中获取一个至六个细胞图像，以便测定最高达每秒六毫米的流速。

数据采集完成后，将小鼠从立体定位仪框架中取出，并使用适当的软件使其从麻醉状态恢复，然后放回笼中。所获取的视频图像经过数字化处理，并获得每个细胞图像的XY坐标数据。细胞位置的确定采用人工方式，而非图像分析方法。

由于经过训练的观察者能够较好地估计细胞中心的位置，而该位置通常对应于所观察到的荧光最强的位置。对于大多数细胞取向，在每条血管中对15个细胞进行位置和速度的测定。当获得血管直径和红细胞速度测量值后，通过平均计算得到平均红细胞速度。

可通过公式 Q = (D/2)² × π × V 计算每条血管中的血流量，其中 Q 表示血流量，V 表示红细胞流速，D 表示血管直径，用于灌注评估及微静脉中白细胞黏附的分析。活体显微镜检查在动物体内进行，该动物被注入含有 FSE 标记的白蛋白与针对泛白细胞标志物 CD 45 的抗体（用 Texas Red 标记）的混合物。荧光标记的白蛋白可更清晰地显示血管网络，包括穿支血管，在脑型疟疾等疾病状态下尤其有用，可用于检测无灌注或低灌注的血管。

荧光标记的抗 CD45 抗体可轻松识别并定量白细胞在微血管中的滚动和黏附。通过计数 100 微米血管长度内的白细胞数量，来实现白细胞黏附的定量。滚动的定量则通过在 30 秒内，计数同一 100 微米血管长度中移动速度明显慢于血流速度的白细胞数量来完成。

以下是通过高速荧光成像结合细胞追踪技术测量微血管中红细胞流速的示例。视频记录图像A至F为微循环的连续帧图像。每幅图像代表一个流动红细胞的位置，由高速相机逐帧捕获。

本图显示了一项代表性实验中随时间变化的脾脏血流情况。在疟原虫、伯氏疟原虫、恶性疟原虫感染的小鼠以及未感染的对照小鼠中，对照组小鼠的脾脏血流随时间相对稳定。而PBA感染的小鼠在脑型疟疾发生时表现出明显的血流下降。

在第六天，使用抗CD45 Texas red荧光抗体染色，可观察到大量白细胞黏附于感染伯氏疟原虫（plasmodium berghei）小鼠的微血管壁。该实验方法的应用范围广泛，远不止今日所展示的这一项。任何可用于活体成像的光学技术均可适配于此模型，借此可研究组织中的氧水平、pH值、活性氧物质以及白细胞与血管内皮相互作用等参数。