一种通过颅窗对新皮层血流进行双光子成像的方法

对活体啮齿类动物完整大脑中的脑血管系统进行成像并记录血流动力学变化，是一种强大的技术手段，可用于脑缺血或正常脑生理学的研究。本文将演示如何利用两种光学显微技术，通过尾静脉注射荧光染料，对活体小鼠新皮层中的血流动力学进行成像。该技术最初由 David Kleinfeld 在 Winfred Dank 实验室开发。

大家好，我是来自加州大学洛杉矶分校神经病学系Carlos Porter Cayo实验室的Ricardo Mota。在之前的视频中，我们向您展示了用于体内长期成像实验的颅窗植入方法。今天，我们将向您展示通过颅窗对大脑皮层血流动力学进行成像的操作流程。

这种制备方法非常有用，因为它允许人们利用双光子激光显微镜对大脑深部进行成像。现在让我们开始操作。为了成像脑血管系统，必须通过静脉向动物体内注射荧光染料。

我们使用右旋糖酐偶联染料，因为右旋糖酐基团可防止染料穿过血脑屏障并从血管中渗出。小鼠采用异氟烷麻醉，诱导浓度为4%，注射过程中维持在1.5%至2%。随后，用70%酒精棉签擦拭尾部进行消毒，使用26号针头经尾静脉注射75至100微升浓度为5%的罗丹明右旋糖酐生理盐水溶液。

在尾静脉注射后，可立即对动物尾部中段进行成像，直至染料通过尿液排出；若使用ERO二聚体染料，尿液将在约两小时后呈现粉红色。在注射荧光示踪染料Dexter约两小时后，用异氟烷对小鼠进行麻醉，诱导浓度为4%，成像时维持在1%至1.5%。将小鼠通过钛金属杆牢固固定于显微镜载物台上，载物台内置温控加热垫以维持动物体温。

涂抹一些眼膏以保持眼睛湿润。用70%酒精清洁颅窗的盖玻片。将颅窗调整至与焦平面平行，并置于视野中央。

在4倍物镜下，最好使用数码相机拍摄脑表面血管的照片。该图像将作为后续成像过程中每天重复定位成像区域的参考图像。随后将4倍物镜更换为40倍水浸物镜。

在不移动载物台的情况下，拍摄视野的数字图像。再次将载物台操纵器的坐标设为零。我们使用 Scan Image 作为图像采集软件。

该程序由 Tom Paul Rudo 和 Bernardo Sabatini 在 Carls Voto 的实验室中使用 MATLAB 编写。接下来，我们开启所有其他设备，包括激光器、功率计、光电倍增管、放大器等。以低倍率快速扫描成像窗口的合适区域，以找到最佳成像区域。

确定这些区域后，对选定成像区域进行低倍镜下的图像堆栈采集，并标注其 XY 坐标，以记录小血管或毛细血管中的血流动力学。我们沿感兴趣血管至少 40 微米的长度进行线扫描。每次单次扫描持续一秒钟，应使用尽可能低的激光功率完成，同时记录扫描的坐标和角度。

成像结束后，将动物转移至温暖的恢复室，使其从麻醉状态中苏醒。此处展示的是使用双光子显微镜，对一只五个月大、经尾静脉注射了荧光标记右旋糖酐的小鼠，通过覆盖于体感皮层上方的颅窗，每隔五微米采集一层、共一百层图像所形成的图像堆栈。该图像序列显示了包括毛细血管在内的大小血管构成的复杂网络。

我们刚刚向您展示了一种通过颅窗在活体中可视化血流动力学的方法。该方法在成像大脑皮层血管系统的血流动力学方面极为强大，例如可用于研究卒中后血流的变化情况。通过重复尾静脉注射荧光染料，可在不同时间点对同一只动物进行多次成像。

进行此操作时，务必牢记应在尽可能洁净和无菌的条件下进行，并且需要非常稳定的手法。好了，就这些。感谢观看，祝您的实验顺利成功。