膜片钳与灌流技术在研究离子通道表达中的应用 非洲爪蟾 卵母细胞

本实验的总体目标是在控制电压的同时控制细胞内溶液的条件下，记录BK通道的激活情况。首先通过向非洲爪蟾卵母细胞注射BK通道mRNA来表达BK通道，以实现这一目标。实验的第二步是准备灌流系统。

该实验步骤的第三步是在卵母细胞膜与膜片电极之间形成吉欧封接。实验的最后一步是分离膜片。最终，通过膜片钳技术结合灌流系统获得的结果表明，BK通道可被电压和钙离子浓度的变化所激活。

大家好，我是来自华盛顿大学Jamie Zus博士实验室的Jin Cho Young。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，包括关于离子通道激活的分子机制的问题。现在，让我们开始吧。

该实验步骤的第一步始于膜片钳记录前的几天，使用体外转录的BK通道mRNA。在获取非洲爪蟾（Xenopus Lavu Cytes）第五至第六阶段的卵母细胞后，向每个卵母细胞中注射0.05至50纳克的BK通道mRNA。使用Nanoject II自动纳升注射仪进行注射。

每种mRNA注射后，需在十余个卵母细胞上重复注射操作。使用ND 96溶液将卵母细胞冲洗两次。随后将卵母细胞放入培养皿中，在18摄氏度条件下孵育两天或更长时间，以使卵母细胞充分表达BK通道。

经过两到五天的孵育后，卵母细胞应已表达BK通道，因此已可进行膜片钳实验。在处理卵母细胞之前，需先准备好膜片钳所需的其他所有设备，首先设置灌流系统。此处展示的系统为自动阀连接装置。

16 个灌注系统通过加压氮气将灌注液从溶液储液罐经灌注管路推入灌注笔和笔尖。每一路灌注液的流动均由一个储液罐阀门和一个电子阀门控制。在本方案中，其中一个储液罐未加压，用作废液收集器，同时也作为压力释放装置。

可在实验前配制不同浓度钙或镁的灌流液。将灌流液加入储液瓶中，并对每个储液瓶进行标记，注明钙或镁的浓度。首先搭建灌流系统，将管路连接至灌流笔。

然后打开电子阀门控制器，并开启电子阀门，确保管路和灌注笔无堵塞和气泡。使用装有去离子水的注射器将去离子水推过每根管路。此时，将管路连接至溶液储液瓶，并打开氮气钢瓶阀门，向系统施加氮气压力。

打开一个储液阀，使储液溶液充满管路。如有需要，点击储液阀以去除溶液中的气泡。待管路充满溶液后关闭储液阀，用水填充灌流尖端，并将其旋紧到灌流笔上。

注意不要引入气泡。连接尖端时，使用油灰将灌流笔固定在浴槽支架上，并确保灌流尖端位于浴槽空间内。灌流系统现已安装完毕。

此时，向浴槽中加入去离子水。确保灌流尖端浸没在水中。测试每种灌流溶液是否均能从灌流尖端正常流出。

关闭连接至废液收集管路的电子阀门，打开其中一种灌注液的阀门。在显微镜下观察从灌注尖端流出的灌注液射流。关闭该灌注液的阀门，打开废液收集器的阀门。

灌流液流应几乎消失。对每种灌流溶液重复进行相同的测试。当确认所有灌流溶液均正常流动后，将浴槽中的去离子水替换为所需的浴液。

现在开始设置记录装置。每次进行膜片钳实验前，应使用氯化银重新涂覆银制记录电极。首先，将电极丝从移液器支架中取出，并将电极丝尖端的一半浸入装有新鲜次氯酸钠溶液的小瓶中，至少浸泡15分钟。

在导线上沉积一层氯化银。用去离子水冲洗电极导线，并用吸水纸吸干。然后将银/氯化银电极重新安装到移液管支架中。

现在打开计算机。将硬件密钥插入计算机的打印机端口。必须插入硬件密钥才能使用数据采集软件，即 HEA 脉冲软件。

打开放大器并启动数据采集软件。HEA 脉冲。加载协议文件，并调整配置设置，例如刺激量程。

调整配置参数的目标是确保测试电位与指令电位完全相等。现在我们准备开始制备卵母细胞。从培养箱中取出卵母细胞。

将卵母细胞浸入剥离液中5到10分钟。剥离液可使卵黄膜与质膜分离，从而能够去除卵黄膜。5到10分钟后，轻轻将卵黄膜从卵母细胞上剥离。

使用两把镊子。受精卵分裂位点极为脆弱，因此应尽量减少移动。注意避免使受精卵暴露于空气或气泡中，使用装有足量溶液的玻璃移液管将卵细胞转移至浴液中。

卵母细胞膜上的通道现已暴露，可进行膜片钳记录。将玻璃毛细管插入微电极拉制仪中，以拉制膜片钳电极。在显微镜下观察电极，确定其尖端形状和开口直径。

开口直径应为2至4微米，以减少记录过程中的电容电流，并确保尖端光滑；用蜡涂覆尖端后进行灼烧。在显微镜下抛光。通过将移液管尖端置于移液管溶液中并拉动活塞来填充移液管尖端。

这一步可润湿移液管的尖端。接下来，使用注射器将移液管溶液注入至移液管体积的三分之一处。然后将移液管连同内部的银/氯化银电极一起放入移液管架中。

确保导线电极与移液管溶液接触。下一步是从制备好的卵母细胞上分离出内面向外的膜片。首先，在显微镜下找到卵母细胞清晰的边缘。

使用操纵器将记录电极移至卵母细胞附近，确保其浸入溶液中。在灌流液中，记录电极的串联电阻。当电极内充满电极填充液并浸入灌流液中时，记录电极理想的串联电阻范围为1至1.5毫欧姆。

现在缓慢推动移液管直至卵母细胞，使其阻力大约增加一倍。通过连接至移液管 holder 的吸管用嘴施加轻柔的负压，以获得吉欧姆封接。确认形成吉封后，在负30毫伏电压下保持数分钟，以稳定膜片。

为了获得一个外翻式膜片，需将移液管快速推入OO位点后轻轻拉出，以切除膜片。此时外翻式膜片已准备好用于膜片钳记录。将持有外翻式膜片的移液管移至距离灌流管尖端开口约100微米的位置。

关闭用于收集废液的电子阀门，打开所需灌流液的储液阀。开始记录膜片上的电流。根据需要改变电压和灌流液。

记录完成后，通过推动去离子水冲洗灌流管路、笔式电极和尖端，以防止堵塞。此处获得的膜片钳记录显示，卵母细胞膜片上的野生型BK通道对电压和钙离子均有响应。该图显示了灌流液中钙离子浓度为名义零值时的膜片记录结果。

电流轨迹上方的方波表示施加于膜片的电压。施加了四个电压，范围从50毫伏到200毫伏，以50毫伏为增量递增。在200毫伏的最大电压下获得最大电流，约为2纳安。

随着电压的增加，电流幅度的上升表明BK通道的开放概率随电压升高而增加。该图显示了内面向外膜片在不同电压下的反应。当灌流液中含有1微摩尔钙离子时，施加了电压阶跃。

与上图类似，在施加200毫伏电压阶跃时，当灌流液中含有钙离子时，上方的电流响应增加至约3纳安，而无钙离子时仅为约2纳安。这表明BK通道的开放概率在钙离子存在时升高。综上所述，该膜片钳实验结果表明，BK通道具有电压和钙离子依赖性。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用膜片钳技术结合推进燃料系统记录铁通道的激活。现在，感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。