优化的转染策略用于在HEK-293T细胞中表达及记录重组电压门控离子通道的电生理特性

电生理学常用于研究在培养的人胚胎肾细胞中表达的重组电压门控离子通道的活性。成功的记录要求细胞在细胞膜上表达足够水平的通道以便检测，并且细胞铺板密度需足够低，以分离单个细胞。进行细胞记录时常受到限制，原因是通道表达通常需要在28摄氏度下长时间孵育，而此过程往往导致细胞黏附性和膜稳定性下降。

在此展示了一种优化的细胞培养与转染方法，可规避上述问题。细胞在中等汇合度下进行转染，随后在28摄氏度下孵育，直至离子通道表达达到足够水平。转染后的细胞以低密度接种于玻璃盖玻片上，并在37摄氏度下孵育数小时，以促进细胞贴附和膜稳定性。

通过共表达的EGFP和全细胞膜片钳技术鉴定已适当接种的细胞。可直接进行记录，或再次将细胞置于28摄氏度条件下孵育。为进一步提高通道膜表面表达，对转染了电压门控钙通道（如L CAV1、L CAV2或L cav3）的细胞进行记录实验的结果表明，这些通道已成功转染并在细胞中表达。

尽管本实验室仅展示了LCAT三的代表性结果，但我们已开发出一种方法，可增强在人源细胞系中表达水平较低的离子通道基因，以用于膜片钳记录。传统方法是首先将细胞接种到盖玻片上，转染含有离子通道基因的质粒cDNA，随后在28摄氏度下孵育多天，以在电生理记录前实现高效的离子通道表达。我们的新方法显著缩短了记录前在28摄氏度下所需的孵育时间。

通过缩短至28摄氏度的孵育时间，我们发现细胞膜更加稳定，转染后的细胞在盖玻片上的贴附性也显著增强。这增加了可记录细胞的数量，并显著提高了实验效率。在转染前，将一个完全融合的HEK 293T细胞培养瓶以1:4的比例传代至一个新的25平方厘米培养瓶中，并将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养。

接种细胞后静置3至4小时，然后通过差分干涉对比显微镜观察细胞，以确认其已贴壁。注意此时细胞不再呈圆形，而是逐渐变平，并可见细胞突起或伪足。

融合度较低的细胞外观相同，但细胞间距会更大。待细胞贴壁后，混合必要的试剂以进行标准的磷酸钙转染。每瓶准备总量为12微克的DNA，溶于600微升转染溶液中。

此处将来自各种离子通道的cDNA克隆到P-I-R-E-S双EGFP质粒中。将该表达载体转染至哺乳动物细胞系后，可在同一mRNA上产生增强型绿色荧光蛋白（EGFP），其翻译起始位点位于离子通道编码序列下游、EGFP编码序列上游的内部核糖体进入位点（IRES）。这种方法使得转染成功的细胞能够被识别，同时避免了将EGFP蛋白直接融合至目标蛋白时可能对蛋白功能造成的干扰。

将转染液逐滴加入细胞中，然后轻轻摇动培养瓶，并于次日将其置于37摄氏度培养箱中过夜。通过荧光显微镜观察细胞以检测转染效率。成功转染的细胞应在整个细胞内呈现绿色荧光。

在确认转染成功后，小心地将四到五毫升预热的培养基加入倒置的培养瓶中。通过缓慢翻转培养瓶使细胞面朝下，并轻轻晃动培养瓶，使洗涤液轻柔地流过细胞表面，从而清洗细胞。移除培养基后，重复此洗涤步骤。

重复上述步骤两次。然后向烧瓶中加入六毫升培养基，在37摄氏度下孵育两小时。无脊椎动物离子通道的表达存在一些挑战。

首先，它们通常分子量较大，因此在内质网上翻译可能需要较长时间。此外，在哺乳动物细胞系中，它们可能无法被高效地靶向至细胞膜。最后，由于不同物种的密码子使用频率不同，异源 cDNA 可能含有在哺乳动物细胞（如 HEK 293T）中罕见的密码子，从而导致翻译效率低下；为克服其中一些困难，可采取相应优化策略。

转染后洗涤，在37摄氏度孵育两小时，随后将培养瓶转移至28摄氏度培养箱中继续孵育2至6天，以延长表达时间。孵育时间需根据所表达的每种离子通道类型通过实验确定。由于在28摄氏度长时间孵育会导致细胞脱落和细胞膜稳定性下降。

在进行电生理学研究之前，需要进一步制备细胞。首先，用移液管吸除转染细胞的培养基，并向倒置的培养瓶中加入一毫升37摄氏度的胰蛋白酶溶液。然后轻轻将培养瓶恢复至细胞面朝下的位置，使胰蛋白酶缓慢流过细胞表面。

将培养瓶翻转回来并吸除胰蛋白酶。然后在细胞上直接加入250微升预热的胰蛋白酶，于37摄氏度孵育3至5分钟，直至细胞脱落。在此期间，将3至8个经多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片放入60毫米的培养皿中，并加入5毫升预热的培养基。

待细胞脱离后，用移液器上下吹打约六次，将细胞重悬于4毫升预热的培养基中。接着，用微量移液器的枪头轻压盖玻片，确保其完全贴附于培养皿底部。然后加入250至500微升重悬的细胞悬液。将细胞置于37摄氏度培养箱中孵育3小时，使其充分贴附于盖玻片上。

在37摄氏度下孵育时间过长会导致细胞分裂，从而稀释转染的质粒。转染后的细胞应以足够低的密度接种，使其彼此分离，如图所示。这将有利于进行电生理记录。

对于需要辅助亚基的细胞，通常需将细胞转移至28摄氏度，并额外孵育三至四天，然后进行电生理记录。对于不需要辅助亚基的细胞，则可在孵育结束后立即进行记录。

此处使用的电生理设备包括放大器、电动双移液器操纵器、落射荧光显微镜以及灌流系统。所有设备均安装在防震台上，并配有防杂散电场的屏蔽罩。通过一个40英寸高的II型铁磁屏蔽笼来限制电噪声。电子控制系统包括一台配备Digit Data 1440的计算机、一个模数转换器接口，以及与P-Clamp 10.1软件协同工作的系统。

计算机显示器放大器、电动操纵器以及阀控灌注系统均安装在法拉第笼外部。所有电子设备安装在一个独立的19英寸金属电气机架上，并接地至铜质配电端子，同时接入医用级隔离变压器，以提供线路绝缘、稳定的接地和浪涌抑制。实验前，将经火焰抛光、电阻为2至5兆欧的微电极安装在头部支架的微电极夹持器上。

用内部溶液填充膜片电极，轻弹以去除气泡，最后安装到显微镜的电极架上。接着，用镊子将载有培养细胞的盖玻片转移至一个含有3毫升室温外部记录液的35毫米塑料培养皿中。在进行药物实验时，必须准确测量记录液的体积，以便用微量移液器向培养皿中加入已知量的药物，然后将培养皿置于显微镜载物台上。

然后用3摩尔的氯化铯填充微电极夹持器半电池。将参考电极插入半电池中，并使用显微操作器将接地电极放入浴液中，再将膜片钳电极移入浴液。在荧光模式下观察细胞，并将一个孤立的、呈绿色荧光的转染阳性贴壁细胞置于视野中央。

在灌流模式下，将记录电极移至细胞附近。将计算机屏幕上观察到的方波信号调零。调整记录电极的位置，使其刚好接触细胞，此时屏幕上的方波电流信号开始出现波动。

使用连接的注射器施加轻柔的负压，直至形成吉欧姆封接。一旦达到吉欧姆封接，立即将程序切换至膜片钳模式。用注射器施加短暂的负压脉冲，以击穿细胞膜。

然后切换到细胞模式，并在放大器上使用全细胞记录参数。为了补偿电容性瞬变，需要平衡膜片，使细胞内记录液扩散进入被封接的细胞。在此处输入为本实验设计的电压钳制程序。

实验人员设计了一种方案，用于测量当细胞膜两侧电压发生变化时，通过电压门控离子通道的离子电流。在此情况下，我们采用一种IV方案，该方案要求软件先将细胞钳制在负110毫伏，然后阶跃至负70毫伏并持续250毫秒，随后返回至负110毫伏的保持电位，每次阶跃增加10毫伏，即依次至负70毫伏、负60毫伏等，直至最后一步达到正20毫伏。

使用放大器上的低通贝塞尔滤波器以10千赫兹对记录的电流进行滤波，并利用Clampex 10.1软件以2千赫兹的采样频率进行数字化。仅使用漏电流小于10%的记录进行分析。在分析中，将HEK 293T细胞进行培养，并转染如图所示的L Cav 3型钙通道。异源性离子通道cDNA的成功转染由P-I-R-E-S双eeg FP载体产生的荧光指示。

在此，我们展示了无脊椎动物cav三型电压门控钙通道的成功表达。当细胞未被转染时，无法诱发出钙电流；而转染后的细胞在施加全细胞电压钳制程序时可产生显著的电流。

实验人员可根据自身需求采用不同的电生理条件和数据分析方法。在进行该实验操作时，需注意根据实验时间自行判断和调整。由于不同通道在细胞膜上的表达效率存在差异，因此需要您自行确定最佳策略，以提高细胞存活率，并最大化目标通道在细胞表面的表达水平。

观看本视频后，我们希望您能够充分掌握如何培养和维持人源细胞系，以及如何将异源离子通道cDNA和亚基cDNA转染到这些细胞中，用于电生理记录。