记录间隙连接电流 非洲爪蟾 卵母细胞

在非洲爪蟾卵母细胞中异源表达连接蛋白（connexins）和无脊椎动物连接蛋白（innexins）是分析缝隙连接生物物理特性的有力方法。我们技术的主要优势在于采用高侧电流测量法，适用于双位点电压钳制。该实验操作将由我实验室的博士后研究员 Yuan Shui 演示。

当70%至80%的卵母细胞完成去滤泡后，轻轻倾斜试管，倾去酶溶液。用ND96溶液将卵母细胞洗涤五次，每次加满溶液后倾去。最后一次洗涤后，将卵母细胞转移至含有ND96溶液的60毫米培养皿中。

使用洁净的玻璃巴斯德移液管挑选外观较大且健康的卵母细胞，并转移至含有添加了丙酮酸钠和青霉素-链霉素的 ND96 溶液的 60 毫米培养皿中。通过将一小块尼龙网固定在 35 毫米培养皿底部，制备卵母细胞注射用培养皿。向该卵母细胞注射培养皿中加入约半满的、添加了丙酮酸钠和青霉素-链霉素的 ND96 溶液。

然后，将25至30个卵母细胞成行放置于培养皿内。用轻质矿物油回填注射用微毛细管，并将其插入显微注射仪的毛细管夹持器中。通过移液，将储存的cRNA分装样品之一转移至培养皿盖子或底部的内表面。

按下注射器控制器上的填充按钮，将cRNA液滴吸入微毛细管的尖端。然后，按下注射按钮注入cRNA。将已注射的卵母细胞转移至一个新的培养皿中，该培养皿含有添加了丙酮酸钠和青霉素-链霉素的ND96溶液。

将卵母细胞置于环境培养箱中，在15至18摄氏度条件下孵育1至3天。每天更换溶液，将卵母细胞转移至新的培养皿中。使用两把精细镊子轻轻剥离包裹卵母细胞的透明绒毛膜。

然后，将两个卵母细胞放入含有 ND96 溶液的卵母细胞配对室的每个孔中。将差分电压探头和电流线缆连接到模型细胞上。接着，使用附带的跳线将红色和黑色插座连接至差分电压探头，并将跳线的任意一端连接至模型细胞中的任意一个插针。

将模型细胞中的接地线连接到放大器接地电路插座的电缆上。调节VM偏移和VE偏移旋钮，使膜电压和膜电流表读数归零。将钳制模式从“关闭”切换至“快速”或“慢速”，然后顺时针旋转增益旋钮至适当水平，以实现正确的电压钳制，使放大器的电压电极和浴槽电极表读数归零。

运行一个包含几个电压阶跃的简单采集程序，以确认膜电压计上显示的电压能够根据采集程序发生变化，并且电压和电流信号在Clampex中正确显示。将含有配对卵母细胞的培养皿放入记录平台的培养皿托槽中。选择一对卵母细胞，如有必要，旋转培养皿，使两个卵母细胞分别位于左侧和右侧方向。

通过磁性底座将载物台固定在指定位置。将参比电极放置在培养皿边缘靠近使用者的一侧。然后，仅将参比电极连接到两个差分电压探头中其中一个的黑色插孔。

取一对玻璃微电极，使用金刚石刻刀折断尖端一小部分，并通过火焰抛光使尖端边缘平滑。将微电极置于酒精灯火焰上方，在距离尖端约一厘米处将其弯曲成平滑的角度。用ND96溶液完全反向填充玻璃电极，然后将其插入已预填充的微电极夹持器中。

确保系统中无气泡存在。将微电极夹持器的两毫米插针插入差分电压电极连接线的两毫米插孔中。将两毫米插孔固定在磁性底座夹具上，并将差分电压电极的尖端对准两个卵母细胞中的一个。

将差分电压电极连接线的1毫米插针插入同侧差分电压探头的红色插孔中。使用玻璃毛细管制备电压和电流电极，并用氯化钾溶液从后端填充。然后，将电极插入放大器配套的电极架中。

将电极放入浴液中，并调节膜电压和膜电流表的 VM 偏移及 VE 偏移旋钮至零。通过按下 VM 电极测试和 VE 电极测试按钮检查电极电阻。将电流电极和电压电极插入卵母细胞中，观察负的膜电位。

接下来，在放大器的钳制部分，确认直流增益处于“in”位置。顺时针旋转增益旋钮至适当水平，以实现正确的电压钳制，并将钳制开关从“off”拨至“fast”。最后，运行采集程序。

此处显示了卵母细胞实验的示意图。从负30毫伏的保持膜电位开始，对卵母细胞1施加负向和正向的膜电压阶跃，而卵母细胞2则保持在负30毫伏的恒定膜电位。跨接电压（Vj）定义为卵母细胞2的膜电位减去卵母细胞1的膜电位。

代表性图像显示了 UNC-9 同源性缝隙连接的样本 Lj 膜电流以及归一化连接电导-跨连接电压关系。此处展示了 UNC-7b 同源性缝隙连接的样本 Lj 膜电流及其对应的归一化 Gj-Vj 关系。结果表明，这两种缝隙连接在跨连接电压（Vj）依赖的膜电流（Ij）失活速率、Vj 依赖性以及残余电导（residual Gj）量方面存在差异。在进行该实验操作时，必须确保差分电压电极系统中无任何气泡，其尖端应非常接近卵母细胞，同时电压和电流电极的电阻应约为 1 µΩ。

我们的技术易于实施，可能特别适合那些新近希望利用非洲爪蟾卵母细胞研究间隙连接的实验室。