高分辨率光纤微内窥镜技术用于 原位 细胞成像

传统上，需要在细胞水平分辨率下进行显微分析的生物学和临床研究通常通过并行开展多个实验来完成，即在不同时间点依次取出单个样本，利用光学显微镜进行评估；而共聚焦显微镜、多光子显微镜和二次谐波显微镜均为适用于原位成像的有效技术。这些技术所需的基础设施复杂且昂贵，涉及扫描激光系统和复杂的光源。本文中，我们将展示如何仅使用市售组件，在一天内以不到5,000美元的费用构建一套高分辨率光纤微内窥镜系统。

该平台在图像分辨率、视场范围和工作波长方面具有灵活性。首先，组装一个简单的落射荧光显微镜框架，以容纳光源、光学滤光片、透镜、光纤束和CCD相机。接着，安装成像透镜，将光纤束的放大图像投射到CCD相机上。

随后安装带有照明光学元件的LED光源，以向样品提供荧光激发光。最后，利用组装好的微型内窥镜，实时成像可揭示荧光标记样品的细胞级细节，包括体外培养物、活体动物模型以及人体样本。与共聚焦或双光子显微镜等现有方法相比，该技术的主要优势在于其结构足够简单且成本低廉，使得在不同领域工作的研究人员能够快速实施并根据其特定需求进行定制。

此处所述的高分辨率微型内窥镜应视为一种基础配置，其组装和应用均可存在多种变体。在为特定应用选择组件时，需考虑荧光显微镜中荧光染料浓度、光漂白照射、光强、相机灵敏度、增益和曝光时间之间的内在关系。该平台设计用于以丙酮酸黄（pro flavin）作为荧光对比剂，但也可配置为适用于其他荧光染料。

原黄素是一种明亮的细胞核染料，其最大吸收波长和发射波长分别为445纳米和515纳米。若使用其他对比剂，用户需适当选择激发、发射和二向色滤光片，以组装显微内窥镜系统。首先，将两根6英寸的笼杆连接到两根1.5英寸的笼杆上，形成一对7.5英寸长的杆件。将杆件拧入折叠反射镜单元的一个侧面，然后安装一个直径为1英寸的反射镜。

接下来，将四根 0.5 英寸的杆拧入折叠镜组件的对侧表面。通过笼式立方体下方的两个通孔，将其滑入 7.5 英寸的笼杆上。将两英寸的杆拧入笼式立方体的侧面。

使用 C 接口转 SM1 适配器，将相机连接至笼式安装板。将笼式安装板固定在 0.5 英寸笼杆上，使其与折叠反射镜单元的端面齐平。选择一个直径为 1 英寸的管镜，以便在相机上形成光纤束的图像。

应选择镜头的焦距，使得光纤束端面被至少两个像素采样。将镜头成像至相机时，将镜头插入一段长度为三英寸的镜头筒中，并用卡环固定镜头。使用开口扳手有助于将卡环旋入较长的镜头筒中。

将发射滤光片放入三英寸透镜筒内，置于第一个固定环上方，并添加另一个固定环以固定滤光片位置。确保滤光片的朝向符合滤光片制造商所标明的惯例。将透镜筒旋入笼式立方体靠近CCD相机一侧的接口中。

此位置在此处也已标示。请注意，在示意图中，该透镜和滤光片未显示三英寸透镜管。为便于观察，将相机连接至计算机并在屏幕上查看图像。

将笼式组件对准远处物体，并沿导轨滑动笼式立方体，直至该物体的图像清晰聚焦。使用螺丝刀拧紧位于笼式立方体侧面的四个螺丝，这些螺丝在拧紧时会夹紧导轨，从而将立方体固定在当前位置。

这将确保管镜与无限远校正物镜结合时，能在相机上形成光纤束的聚焦图像。接下来，将二向色镜插入镜架中，并以45度角放置于笼式立方体中。通过RMS转SM1螺纹适配器和可调透镜套管，将物镜拧入笼式立方体与管镜镜架相对的端面。

然后，将 SMA 连接器拧入一个笼式安装板，并将其固定在杆上，位置大约位于物镜的工作距离处。将底板和端盖安装到笼式立方体的开口侧。接着，将 LED 安装在一块笼式安装板上，并将其滑动至两英寸长杆的末端。

将一个透镜安装到直径为0.5英寸的透镜筒中，使得当该透镜筒旋入笼式立方体侧面时，能够形成LED的像，并充满物镜的后孔径。同时，将激发滤光片安装到该透镜筒中。在此阶段，可使用LED驱动器通过环氧树脂来控制照明光的强度。

将用于1030微米光纤的SMA连接器连接至720微米视场的光纤束。有关光纤连接的具体操作，请参考T Thor Labs公司产品编号为FN nine six的《光纤连接与抛光指南》。

将SMA连接器端面束旋入安装在笼式支架上的SMA插座中，并将束的远端朝向宽带光源，荧光照明即可满足要求。然后在CCD相机上观察束近端面的图像。最后，通过将物镜旋入或旋出笼式立方体来调整其位置。

直到光纤束图像清晰对焦，单个结构应清晰可见。通过在光纤束远端末端连接一个微透镜或透镜组件，可提高微型内窥镜的空间分辨率。这些光学元件的配置方式使得光纤束末端不直接接触组织，而是以缩小的倍率将末端成像到组织表面。

从而提高由光纤束导光效应所决定的空间采样频率。去放大倍数的程度对应于空间分辨率的提升，同时相应地减小视场。根据您的应用需求，选择具有合适放大倍数和工作距离的梯度折射率透镜。

确保透镜的直径与您计划使用的光纤束直径相匹配。将光纤束和梯度折射率透镜分别安装在低倍显微镜或体视显微镜下的三轴手动定位平台上，以实现精确对准。

接下来，在透镜或光纤束端面滴加一滴光学胶。使用手动调节装置，使两个部件相互接触。根据胶粘剂制造商推荐的剂量，用紫外光照射界面以固化胶粘剂。

为了保护梯度折射率透镜及其粘接界面，使用一段短铝质毛细管套住连接处。将毛细管推至连接处，并在毛细管两端各滴一滴环氧树脂固定，再使用热缩管完成组件封装。在进行微型内窥成像之前，需将对比剂施加于待成像的细胞或组织，以实现对细胞和培养物的成像。

首先，用移液器吸出培养基。然后轻轻将原黄素溶液加入孔中。短暂孵育最多一分钟后，用移液器吸出原黄素溶液并弃去。

通过向孔中加入并移除新鲜的 PBS 溶液来冲洗细胞。将光纤束的远端固定在带有 X、Y、Z 轴手动定位装置的稳固夹具中以保持稳定。在向细胞或组织施加染料后进行成像时，将光纤束轻轻接触样品。在计算机屏幕上观察光纤束的图像，可使用相机制造商提供的软件，或任何您希望开发的自定义软件。

调整相机的曝光时间和增益设置，以获得亮度合适的图像。当正确组装后，微型内窥镜将通过相干光纤束传递，作为倒置荧光显微镜运行。为了获得最佳成像效果，需注意确保满足以下三个关键条件。

首先，应将光纤束的近端面无离焦地成像到CCD相机上，以实现系统的最高分辨率。此处展示了光纤束的一部分在焦距不佳、略微聚焦和良好聚焦条件下的成像效果。通过调节物镜相对于光纤束端面的实际位置，可找到最佳焦距。

其次，光纤束的近端面应在整个直径范围内被均匀照射。如前所述，这可通过将照明光学系统配置为科勒照明来实现。此处显示的图像是在采用这种优选配置照射均匀荧光样品时获取的。

临界照明条件下的相应结果如图所示。LED 的结构被成像到光纤束端面，导致这种不希望出现的图案叠加在真实样品结构上。第三，必须确保光纤束的近端和远端端面清洁，无划痕和破损。

在此示例中，成像束端面上附着有碎屑，并且在光纤周缘五点钟位置可见小碎片形式的损伤。可通过与清洁传统光纤连接器相同的方式，使用镜头纸和异丙醇或标准光纤清洁工具清洁束端面以去除碎屑。1483 个细胞用原黄素标记，并将裸露的光纤束轻轻放置在样品上。

当将一个2.5倍的梯度折射率透镜连接到光纤束末端时，实现了空间分辨率的提高和视场范围的减小，如本图所示。在体内成像中，使用外径为0.5毫米的光纤束，通过21号针头插入小鼠乳腺脂肪垫组织，如本视频所示，可清晰观察到由于心动周期引起的运动的脂肪细胞。在本示例中，使用外径为1.5毫米的较大光纤束对一名健康人类志愿者的口腔黏膜进行了成像。

在所有示例中，均使用了黄素原（pro flavin）作为细胞核标记的荧光对比剂。观看本视频后，您应能够充分理解如何设计和组装用于活体细胞与组织荧光成像的光纤显微内窥镜。