视频速率扫描共聚焦显微成像与微型内窥显微技术

本视频演示了如何使用标准的现成组件构建视频速率扫描共聚焦显微镜。扫描共聚焦显微镜依赖于两个扫描镜的协调运动，以将光束在光栅平面上进行扫描。来自第一面扫描镜的光首先在第一组中继透镜上水平扫描，该透镜将其重新聚焦到第二面扫描镜上的一个固定点。随后，相同的扫描运动通过扫描透镜和镜筒透镜传递，将此时已扩束的光束投射到物镜的后孔径上。

第二个镜片的运动速度相对于第一个镜片较慢，同时扫描Y轴，从而实现对图示平面上方和下方区域的扫描，并在样品表面形成矩形光栅。与购买 commercially available 显微镜相比，该方案的主要优势在于成本低廉，并且能够根据成像项目的特定需求对仪器进行定制。在使用任何激光器时，采取适当的安全措施以防止眼睛受伤至关重要。

应尽可能佩戴合适的激光防护眼镜。所有未直接参与光路调整或未在光束附近工作的旁观者或研究人员，均须佩戴防护眼镜。请摘下所有闪亮或反光的手表及珠宝首饰。

最重要的是，务必始终通过使用光束挡板或安装的名片来终止光束路径，从而确保对光束的跟踪和控制。在调整反射镜时尤其如此，因为此时光束的传播路径可能难以预测。此外，切勿使眼睛与光束路径处于同一水平高度。

在组装显微镜之前，若需穿过激光光路平面，请先关闭激光器。确保所有构建所需的设备均已备齐，包括光学平台和90度支架、所有反射镜、透镜和二向色镜，以及相应的夹具和安装硬件、两个扫描反射镜和光电探测器。准备一个信号发生器也很有帮助，可用于测试扫描动作并在准直过程中调节反射镜。

为了确保稳定性，强烈建议将光学面包板用螺栓固定。开始显微镜的搭建时，先将带尾纤的光纤准直器安装在光学支架上，并将此组件置于光学面包板的中央位置。这对应于图中所示蓝色光束的起始点。

打开光源。使用调节螺丝粗略调整光束，使其在水平和垂直方向上均沿直线传播。在光纤准直器前方放置一个光阑。

接着，调节虹膜的高度，使光束通过中心。然后将虹膜沿光路从阿托尔处移开。检查光束的准直情况。

如有需要，使用两个调节螺丝重新调整光束在虹膜上的位置。将安装好的二向色镜置于光路中，并使激光束位于镜面中心。旋转镜架，使光束以约90度角反射，同时确保光束高度保持不变。

通过拧紧支架上的螺丝将反射镜固定在桌面上。然后将安装好的谐振式检流计反射镜置于激光光路中，注意确保激光束位于反射镜表面的精确水平中心位置。

旋转镜架，使激光束以90度角反射。然后大致调整镜面反射，以保持激光束的垂直高度不变。接下来，取两个光阑，将其直接放置在谐振扫描振镜前方。

然后以共振振镜反射的激光束作为参考，像之前一样调整它们的垂直高度。现在以光学面包板上的螺孔作为引导，目视将两个光阑沿直线夹紧固定。调节光路中的第一面反射镜（即二向色镜），使光束在第一个光阑上居中。

然后调节光路中的第二面反射镜，利用共振振镜将光束中心对准第二个光阑。反复调节这两面反射镜，直至光束穿过两个光阑的中心。

确保从谐振振镜反射的激光束仍从近似镜面中心反射。如果光束发生偏移，调整光纤准直器安装座，并重复调节，使光束在两个打开的光阑中心通过。下一步是放置两个中继透镜，将第一个固定的物方远心平面成像到第二个固定的物方远心平面上。

对于这台特定的显微镜，第一中继系统中选用的透镜具有相同的焦距 F，因此此处两面反射镜之间的距离即为四倍焦距（4F）。在此光路配置中，F 等于 90 毫米，因此 4F 位置距离扫描反射镜为 360 毫米。为确保透镜在光路中精确居中，将第一个透镜置于光路中，并观察光路中下一个小孔光阑上的激光光斑位置。随后调节透镜的高度，使光束的垂直中心与小孔光阑的中心对齐。

接下来，调节水平光束位置，使光束在虹膜上居中。使用第二个透镜重复此过程。然后，设置扫描镜，并旋转显微镜，以便于直接放置和对齐原本需要垂直调节的部件。

为了确定第二个物方远心平面的精确位置，将谐振振镜 G 放入其扫描单元并开启。使用一张名片沿扫描光束经过两个透镜的路径进行追踪。第二个物方远心平面位于振镜 G 所在位置约四个焦距处，可通过扫描光束看起来静止不动的位置来确定。

用铅笔在面包板上标记此位置。确定tele centric平面后，将扫描镜输入设为零伏，启动镜片控制硬件，使镜片稳定在其中性位置。然后将标准扫描galil镜片置于tele平面的精确位置。

调整反射镜位置，使tele平面上的光束照射到扫描镜的正中心，并拧紧镜架。然后松开固定gal镜的锁紧螺丝并旋转gal镜，确保光束垂直传播。最后关闭激光器和扫描电子设备。

断开光纤并断开扫描镜。然后使用90度面包板安装支架，将第二块面包板固定到第一块上。

最后，小心地旋转整个显微镜，使新的面包板平放，并使用夹具将显微镜固定在位。在此处重新连接检流计镜（gal o）和激光器，并记得将检流计镜（gal O）调回零电压。 formerly 垂直设置的其余部分可轻松在平放的面包板上完成。

接下来，我们将设置第二组中继透镜，正式称为扫描透镜和管镜。有关选择合适透镜组合的重要信息，请参见随附的书面实验方案。首先开始安装透镜。

首先，布置好用于引导光束至物镜的反射镜。将第一块较大的两英寸反射镜放置在光学平台边缘附近，旋转镜架，使激光束大致偏转约90度。调节镜面反射，以保持光束的垂直高度不变。

然后将另一面两英寸的反射镜放置在面包板的对边，使光束偏转90度，并使用调节螺丝将其固定。接下来，安装两个光阑，并像之前一样调节两个反射镜，使光束居中。随后，将扫描透镜放置在距检流计（gal）焦距距离的光路位置，并调节其水平和垂直位置。

将激光光斑对准位于两个反射镜之间的第一个孔径光阑中心。小心地将直径为两英寸的大管镜放置在距离扫描透镜适当的位置，并调节其水平和垂直位置，使光束在第一个孔径光阑上居中。在此装置中，管镜放置的距离为75毫米加上300毫米。所有组件均已就位。

将gal O连接至标准电学函数发生器或控制电路的输出端，并将峰峰值电压设置为1至3伏。然后使用一张名片开始扫描两个反射镜。在管镜后300毫米的固定平面上定位激光束。

将物镜置于光路中，并确保将物镜的后光阑尽可能靠近固定平面。安装样品台时，需确保可移动的 Z 轴支架在全行程范围内移动时不会与物镜支架发生碰撞。配置共聚焦系统时，首先断开所有电源和光纤连接，然后设置针孔和探测器。

将显微镜组件旋转回面包板上，使其再次固定在谐振扫描镜上。重新连接光纤与准直器、标准扫描镜以及电源、供电和控制电缆后，在控制标准扫描检流计的驱动电压上施加 0 伏特，如同之前在载物台上操作一样，将一片由两片盖玻片夹持的高亮度染料样品放置到位。然后打开激光光源，并将染料样品调至焦点。

使用一张名片调整激光功率，使荧光尽可能明亮。从样品处开始，沿着物镜、扫描系统追踪荧光发射，直至二向色镜，该镜面可反射激光束并透射荧光发射。在二向色镜的另一侧找到该荧光信号。

现在调暗房间灯光。在二向色镜后方放置一面反射镜，将发射光以90度角反射。然后使用带有反射镜的可调光阑，将荧光光束尽可能平行且笔直地引向光学平台。

接下来，将使用 Thor Labs 的空间滤光片笼式安装组件来搭建共聚焦针孔单元。该示意图概述了装置结构。扫描镜位于与固定物镜呈远心关系的静止平面上。

在固定平面之间，用于传递扫描光束的后焦孔径透镜组成对出现。第一对透镜具有相等的焦距，构成一个1:1的望远镜系统。第二对透镜正式称为扫描透镜和管镜，其焦距不必相等，通常作为一个扩束望远镜，以确保物镜的后焦孔径被充分填充。

从样品发出的光经扫描系统返回，并透过二向色镜。短焦透镜或物镜将发射光聚焦通过共聚焦针孔，随后由透镜准直，最终由另一透镜将经过共聚焦滤波的发射光聚焦至光电倍增管上。

将空间滤波单元置于发射光束路径上，并注意将第一个聚焦透镜支架对准发射光束中心。本实验中选用了一个针孔尺寸为 100 微米的空间滤波单元。接下来，在单元内安装一个短焦距透镜，并滑动 Z 向平移支架，直至在针孔表面观察到清晰的聚焦光斑。

确保整个装置沿荧光光束设定的直线方向对齐。将装置固定在光学平台上。现在使用平移台上的调节旋钮，调节两个轴，对针孔安装面进行二维扫描，以找到针孔透过的荧光信号最强的位置。

接下来，将镀膜透镜安装到笼式支架上。使用一张名片作为针孔，在共聚焦单元中寻找通过的荧光离子，并沿立柱滑动镀膜透镜，直至发射的荧光尽可能准直。组装光电倍增管装置。在荧光发射光路中放置一个焦距为50毫米的透镜，并找到其焦点位置。

在面包板上标记此位置。现在完全关闭激光器，并将光电倍增管放置到位，使其窗口尽可能靠近已标记的焦点位置。然后使用可调透镜管，将组件连接至聚焦透镜。

在针孔之后的所有暴露光路周围包裹深色胶带，开启激光器，并将其功率保持在极低水平。小心开启光电倍增管，并在示波器上读取其电压。逐渐增加激光强度，同时提高电压，直至在示波器屏幕上观察到尖峰状信号和/或直流偏移。

通过关闭激光功率或阻断光束路径以观察信号消失，确认该信号确实来源于荧光。最后，反复调整针孔位置，使示波器上的信号达到最大。首先调节聚焦透镜的 Z 轴位置，然后调整 YZ 平移台，至此完成视频速率显微镜硬件的调试。

首先，关闭光电倍增管。然后按照随附书面方案中的示意图连接镜面定制控制板和计算机。该系统可适用于进行共聚焦扫描显微内窥镜检查。

通过将载物台更换为光纤固定载物台，请参见 accompanying text 或详细说明。组装完成的直立共聚焦扫描显微镜与微型内窥镜应如图所示。激光与发射光束已用作视觉引导示意。

在微内窥镜操作过程中，光纤支架用于在实验期间固定成像光纤。该光纤支架可根据需要轻松替换为XY平台。此处所示的正置显微镜平台展示了一个代表性测试图像，该图像是使用视频速率帧采集卡从输入信号生成的，成像对象为一张白色名片上打印的小写字母“m”。已漂白。

白纸含有荧光剂，这些荧光剂容易被紫外光和蓝光激发，从而在暗背景后产生明亮的背景。字母 M 和中心波长为 515 纳米的发射滤光片被选用以收集该荧光发射信号。图像中可观察到轻微的畸变，尤其在图像帧的侧边区域更为明显。

这种失真是由八千赫兹 gvo 反光镜的正弦扫描模式引起的，在随附的文档中有详细讨论。本视频展示了通过扫描一张名片所获得的视频帧率数据。观看此视频后，您现在应该对如何构建和调试视频帧率共聚焦扫描显微镜有了深入的理解。

请务必注意，使用激光光源可能具有极高的危险性，在进行此操作时，应始终采取预防措施，例如摘除所有反光的首饰，并避免在眼睛与光束水平的位置进行操作。