基于胶带黏附取样与荧光技术的联用方法 原位 杂交法用于快速检测 沙门氏菌 在新鲜农产品上

本实验的总体目标是将基于粘性胶带的生鲜农产品取样方法与利用快速荧光C二杂交技术（又称FISH）对沙门氏菌属进行全细胞分子检测相结合。该方法首先将粘性胶带贴附于目标样品表面，以提取附着在表面的微生物细胞。所得的细胞富集胶带可直接进行分析，也可进一步进行固相或液相增菌处理。

该操作流程的第二步是针对在肉汤中增菌或富集的细胞，进行原位固定以及通过乙醇系列脱水。第二步包括在悬浮状态下固定细胞，随后将细胞重悬于保存缓冲液中。第三步是在膜上进行快速杂交反应，使用针对沙门氏菌的特异性寡核苷酸探针混合物，然后用洗涤缓冲液冲洗以去除多余的探针。对于通过传真分析的样品，荧光原位杂交步骤在悬浮体系中进行，且可在分析前通过简单的稀释步骤去除过量探针。

该实验步骤的最后一步是用DPI对杂交后固定在胶带上的细胞进行复染，并使用荧光显微镜进行观察。对于基于事实的分析，无需进行复染。最终，该方法可提供一种可视化或细胞计数检测手段，用于检测采样新鲜农产品上可能存在的沙门氏菌种类。

我最初产生这种方法的想法，是在阅读一个意大利研究团队的工作时，他们曾采用类似的方法来分析罗马航空石质文物上的细菌群落。但我和R在一门我讲授的食品微生物学快速检测方法课程中，对该研究进行了讨论。几周后，一起可追溯至新鲜农产品的沙门氏菌暴发事件开始蔓延，最终导致美国43个州近1500人患病。

尽管我们的实验方法为检测新鲜农产品上的特定细菌类型提供了一种及时且实用的途径，但其便携性也足以支持在田间或食品生产环境中进行检测。首先选择用于取样的胶带，可选方案包括市售的真菌检测胶带或接触胶带，这些胶带均为无菌包装，便于使用。

使用永久性记号笔和无菌铝制模板，在一段10厘米长的胶带非黏性面绘制1厘米见方的方格。该方格将作为视觉参考，用于标记胶带中已用于采样的区域。将胶带黏性面朝向待采样的食物或环境表面，形成一个“C”形的环状结构。操作时，用拇指和中指夹住胶带的黏性末端，并将食指置于胶带背面已绘制的方格处。

将胶带放置在待采样的表面，并轻轻按压胶带标记区域与表面接触，注意不要松开胶带边缘。用食指确保胶带的粘性面与样品表面完全接触。以均匀的动作操作，避免产生气泡。

缓慢地将胶带从样本上拉开。通过物理方式快速提取表面附着的微生物，以固定细胞电荷。将胶带有黏性的一面朝上贴在玻璃显微镜载玻片上。使用普通的透明办公胶带时，应确保胶带张力适当并充分拉伸，以形成平整无皱的表面。

这有助于在后续加热过程中尽量减少胶带变形或卷曲的问题。在杂交过程中，将胶带正面朝下放置于木糖切片四分之一培养基或XLT四分之一琼脂平板上，使采集的细胞直接接触琼脂表面，以便于将胶带从琼脂表面轻松移除。

富集后，将胶带上的模板样本接触部分平整地贴附于农业表面，并将胶带一端轻轻粘附固定。将培养皿的侧壁倒置，以避免冷凝，随后在35摄氏度下进行孵育。为了使沙门氏菌充分生长，所需的孵育时间长短取决于初始沙门氏菌污染水平，以使细胞富集至可检测水平。

在完成所需的富集时间后，打开琼脂平板，胶带在孵育过程中将保持其黏性。用食指轻轻按压胶带与琼脂接触的表面，以确保在胶带与琼脂界面处形成的微菌落获得最大程度的回收。从胶带附着于培养皿壁的一侧边缘将其捏住，并以缓慢而均匀的动作将其揭下。使用普通的透明办公胶带，将带有细胞的胶带黏性面向上固定于显微镜载玻片上，形成一个平整无皱褶的表面。

在25摄氏度条件下，用500微升10%中性缓冲甲醛覆盖样品接触区域，进行膜上细胞固定，持续30分钟。在通风橱内将固定液弃入可密封容器中，以尽量减少接触刺激性或有毒蒸气。用一倍磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗膜表面一次，以洗涤膜。使用梯度乙醇系列进行处理，并使用市售分子生物学级试剂配制预杂交、杂交及洗涤缓冲液，用0.22微米滤器过滤，将杂交和洗涤缓冲液预热至55摄氏度。

将荧光标记的寡核苷酸探针加入预热的杂交缓冲液中，使探针终浓度为每微升五纳克。用300微升含有探针混合物的杂交缓冲液覆盖胶带上的模板样本接触区域，并将胶带结合的细胞置于湿润密封的孵育 chamber 中，在55摄氏度下孵育。若使用直接接触式孵育设备（如载片模式仪器），孵育时间为15分钟。杂交完成后，取出载片，弃去含有探针的杂交缓冲液覆盖层。用预热的洗涤缓冲液通过移液进行短暂而轻柔的冲洗。

在倾斜的载玻片上加入少量缓冲液，使载玻片自然风干，以便通过荧光显微镜检测沙门氏菌。在载玻片上覆盖约10 µL含dpi的封片剂Vector Shield H 1200（核复染剂），避光孵育10分钟。在盖玻片上滴加镜油，使用高倍油镜观察样品。

使用DPI滤光片使样本聚焦。然后将显微镜切换至适当的滤光片，根据所用染料标记探针的情况，通过绿色或红色荧光在显微镜下目视计数沙门氏菌细胞。为了进行流式检测，将PBS悬浮的样本转移至5 mL圆底流式管中，并使用激发波长为647纳米的流式细胞仪进行检测。

使用 FlowJo 软件分析数据。通过胶带采样法从人工污染的番茄表面获取鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella serovar Typhimurium），可直接用于显微镜或流式细胞术的细胞检测分析。根据胶带上沙门氏菌细胞的初始局部浓度，采用针对沙门氏菌的特异性 DNA 探针并结合 Texas Red 荧光标记，对胶带样本进行快速荧光原位杂交处理。

固相富集结果呈现从孤立的微菌落至融合生长的不同情况。通过胶带取样的细胞可立即进行荧光原位杂交（FISH）与流式细胞术联合分析，也可在35摄氏度下进行五小时液体表面微培养富集后分析。

尽管我们已描述了胶带鱼法在食品安全领域的应用，但该方法在其他学科中也具有良好的应用潜力，包括环境微生物学、植物病理学或临床微生物学。在本实验流程的基础上，还可对胶带提取样品的固体或液体增菌培养物进行生化检测或PCR等附加实验。这些检测可用于回答有关可能存在沙门氏菌的问题，而这些问题超出了鱼法的检测范围。