使用电化学传感器进行细菌检测与鉴定

以下实验的总体目标是利用电化学传感器检测并鉴定细菌。首先从细菌中释放核糖体RNA，以便与氟化检测探针进行杂交，这是第二步；然后将结合了核糖体RNA的检测探针加入工作电极，使其与传感器表面的捕获探针发生杂交。接下来，抗荧光素-辣根过氧化物酶偶联物与氟化检测探针结合。

最后，在干涉测量电流中，可获得其强度与传感器表面捕获探针核糖体RNA检测探针复合物数量相关的信号。该技术相较于基于培养的方法主要优势在于，可在约45分钟内实现细菌的检测与鉴定，避免了过夜培养所需的时间。对于细菌在EDGAR平板上形成可见菌落的应用而言，该技术将有助于改善感染性疾病的管理。

由于细菌病原体的早期检测对于靶向抗生素治疗和改善临床预后至关重要。尽管该方法可用于感染性疾病的诊断，也可应用于其他诊断问题，例如免疫诊断。首先将扩增的捕获探针与己二硫醇在室温下孵育10分钟，以确保捕获探针上的巯基被还原，从而获得更一致的结果。

孵育后，用氮气流吹扫金表面的16个传感器阵列芯片5秒，以去除任何水分或微粒。需小心地将少量液体加至传感器阵列的工作电极上。该技术的可视化演示至关重要。

正确执行移液、洗涤和干燥技术可显著降低芯片间的变异。接下来，将6 µL HDT稀释的捕获探针混合物加至传感器阵列全部16个传感器的工作电极上，并将传感器芯片置于培养皿中加盖，于4°C下孵育过夜。次日，用去离子水冲洗传感器芯片2至3秒，然后在氮气流下干燥5秒。随后，向全部16个传感器的工作电极上加6 µL氯化氢-氯化钠-EDTA-巯基乙醇溶液，并将传感器置于室温下的培养皿中孵育50分钟。

为电化学传感器检测准备样品。取一毫升处于对数生长期的细菌培养物，转移至微量离心管中，然后在16,000 ×g 条件下离心五分钟。请注意，病原菌应在生物安全柜中操作。

去除 snat 后，将含有 10 微升 1 摩尔氢氧化钠的移液枪头插入微量离心管底部，上下吹打数次，充分重悬沉淀。将悬液在室温下孵育 5 分钟后，加入 50 微升含有牛血清白蛋白（BSA）和荧光素标记检测探针的 PBS 溶液，以中和细菌裂解物。随后将中和后的裂解物在室温下孵育 10 分钟。

从已准备好的一个传感器芯片开始此步骤，用去离子水冲洗巯基乙醇溶液，持续两到三秒。按照前述方法干燥芯片后，将四微升中和后的细菌裂解液施加到工作电极上。14个传感器。

然后将4 µL桥接寡核苷酸加入含PBS、BSA及荧光素标记检测探针的溶液中，并将其施加至两个阳性对照传感器上。随后，将裂解液和阳性对照传感器孵育15分钟，之后同前法清洗并干燥整个传感器芯片。现在，将4 µL含抗荧光素辣根过氧化物酶（HRP）的PBS溶液（含酪蛋白）施加至全部16个传感器的工作电极上。

孵育15分钟后，清洗并干燥传感器芯片。接着，将薄膜孔贴片贴到传感器芯片表面，将芯片装入传感器芯片架中，用移液器向全部16个传感器各加入50微升TMB底物，然后盖上传感器芯片架。最后，使用Helios芯片读取仪对全部16个传感器进行热辐射测量和循环遥测数据采集。

上述电化学检测方法的结构类似于三明治式 ELISA，如图所示：靶标核糖体 RNA 与捕获探针和检测探针发生杂交，随后通过辣根过氧化物酶（HRP）催化的氧化还原反应显色；该 HRP 标记于抗荧光素抗体片段上，可结合检测探针上的三磷酸荧光素连接基团。影响检测灵敏度的一个关键因素是金电极的表面化学性质。金电极表面涂覆有巯基乙醇和氢醌，并通过添加稀释的捕获探针实现功能化。

靶标核糖体RNA与捕获探针及荧光素标记的检测探针发生三明治杂交，形成复合物；通过加入抗荧光素-辣根过氧化物酶偶联物和TMB底物，可检测该复合物。M参数电流由辣根过氧化物酶介导的TMB氧化以及电极提供的电子对TMB的还原所形成的氧化还原循环产生。本实验所采用的方法使用了包含16个传感器阵列的基因流体芯片。

阵列中的每个传感器均包含三个电极：工作电极、参比电极和辅助电极，这些电极在芯片边缘设有接触点。芯片读取器带有探针（pogo pins），可与各个接触点连接。芯片读取器作为传感器阵列与由计算机算法控制的电位计之间的接口。

此处展示了电化学传感器电流流动的示例。在开始参数测量后的最初几秒内，传感器中的电流流动人为地偏高。由于从将TMB施加到传感器表面到启动读数仪算法这段时间内氧化底物的积累，电流随后迅速达到稳定状态，可在60秒内可靠地获得准确的传感器读数。

传感器之间的变异性相对恒定，因此可以在基因流体16传感器阵列芯片上并行进行16种不同的传感器检测。阳性和阴性对照至关重要。作为阳性对照，使用一种合成的桥接DNA寡核苷酸，该寡核苷酸可与捕获探针和检测探针均发生杂交，并作为已知浓度的合成靶标。通过桥接寡核苷酸获得的结果可作为内部校准对照，以最大限度地减少芯片间的变异。

电极的负电流越大，信号越强。在测试捕获探针和检测探针时，应通过已知浓度样品的系列稀释来确定检测限；如图所示，在检测方法的动态范围内，样品浓度与信号输出之间存在线性的对数-对数相关性。

在这些柱状图中，显示了含有大肠杆菌（esia coli）、克雷伯氏菌（kleb seal）和氨的样本的代表性结果，这些成分常在尿路感染患者的尿液中被发现。大多数传感器的信号会较低且相似，这些阴性结果可归为背景信号。KE探针组合对克雷伯氏菌与大肠杆菌的反应具有区分能力。桥接寡核苷酸作为阳性对照和内部校准标准。该技术可通过测量细菌对抗生素的表型反应，应用于临床标本中抗生素耐药菌的检测。

该技术可用于确定个体患者的最优治疗方案。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过比较芯片中不同物种特异性传感器的腔室电流来检测和鉴定细菌。