悬浮培养HEK293细胞瞬时转染实现人源重组蛋白的高效表达

本实验的总体目标是通过将重组蛋白靶向至内质网和高尔基体介导的分泌途径，实现哺乳动物糖蛋白在哺乳动物细胞中具有适当糖基化的表达。该方法有助于回答免疫学领域的关键问题，例如特定糖基化模式在抗体及抗体片段结构与免疫激活潜能中的作用。该技术的主要优势在于利用人类细胞表达人类蛋白质，从而提供适当的细胞环境，以正确折叠和修饰目标蛋白。

用于细胞建系的摇床培养箱应在接种培养前至少一小时以135 RPM、80%湿度、8%二氧化碳和37°C的条件开始运行。打开生物安全柜的紫外灯，将密封的A培养基和B培养基瓶置于37°C水浴中预热。关闭紫外灯，并使用70%乙醇与水的溶液对生物安全柜进行消毒。

使用70%乙醇水溶液喷洒125毫升带通气盖的锥形培养瓶、移液管、移液器及预热的培养基瓶，进行灭菌处理。在整个操作过程中，将这些物品放置于生物安全柜内。所有物品在放入生物安全柜之前，均须以该方法进行灭菌。

通过移取26毫升培养基A和3毫升培养基B，配制30毫升新鲜培养液，并转移至125毫升锥形瓶中。轻轻振荡混匀。将一管先前在-80摄氏度冷冻保存的HEK 293F细胞置于37摄氏度水浴中温育，使其部分解冻。此过程约需1分钟，细胞不应完全解冻。

接下来，用70%乙醇水溶液对外部的瓶身进行消毒，并将其移入生物安全柜中。使用1毫升移液器吸取细胞悬液，转移至含有29毫升新鲜培养基的125毫升锥形瓶中。盖上培养瓶盖，将锥形瓶放入摇床培养箱中培养24小时。

培养接种后24小时。检查细胞密度，用70%乙醇与水的混合溶液对培养瓶进行消毒，并将其移入生物安全柜中。使用1毫升移液器缓慢吸取100微升培养液，转移至无菌的0.5毫升离心管中。

尽快关闭培养瓶的瓶盖，并将培养瓶放回摇床培养箱中。取7.5 µL台盼蓝溶液与7.5 µL细胞混合，充分混匀后，取7.5 µL混合液转移至细胞计数板。

打开自动细胞计数器，将计数板放入加载室中。自动读取器将被激活，细胞将自动计数，结果以每毫升细胞数和存活率百分比表示。确定需要从供体培养物中转移至新鲜培养基的体积，以获得每毫升30万个活细胞的细胞密度。

按照先前方法，将23毫升培养基A和3毫升培养基B转移至一个新的125毫升培养瓶中，配制新鲜培养基。随后，将培养基A和培养基B的储备瓶从生物安全柜中移出，以降低污染风险。从培养箱中取出HEK 293 F细胞培养瓶。

用70%乙醇与水的溶液喷洒，并将其放入生物安全柜中。使用新的移液管，从培养物中吸取正确体积的细胞，转移至含有新鲜培养基的培养瓶中。将两份培养物从生物安全柜转移至摇床培养箱中。

转染前将细胞培养至每毫升约200万至300万个活细胞的密度。按照之前演示的方法检测细胞密度，并确定转染所需的细胞数量。使用无菌刻度移液管。

将适当体积的细胞悬液转移至250毫升离心管中。在100 × g 条件下离心5分钟以收集细胞。灭菌后，将含有细胞沉淀的离心管转移至生物安全柜中。

使用无菌移液管弃去含有用过的培养基的上清液，用 10 毫升新鲜培养基通过反复吹打重悬沉淀的细胞，并转移至含有新鲜转染培养基的预置培养瓶中。拧紧通气细胞培养瓶的瓶盖，将培养瓶置于摇床培养箱中孵育 15 分钟至 1 小时，期间细胞进行孵育。

使用新鲜培养基将血浆DNA和聚醚胺（POLYETHERAMINE）或PEI储备液稀释至终浓度为每微升0.5微克。从摇床培养箱中取出含有分散细胞的培养瓶，转移至生物安全柜中，用微量移液器向培养液中加入300微升血浆DNA，轻轻手动振荡混匀，然后加入900微升PEI，再次混匀。最后加入3.8毫升新鲜培养基。

将烧瓶转移至摇床培养箱中培养24小时。转染后24小时，必须对细胞培养物进行稀释。首先准备稀释培养基：使用无菌的1毫升血清移液管吸取1毫升预热的220毫摩尔伏立诺他（valproic acid，VPA），转移至无菌的50毫升离心管中。

接下来，使用无菌刻度移液管向VPA溶液中加入5毫升预热的B培养基和44毫升预热的A培养基。这样可得到50毫升新鲜培养基，其中VPA的终浓度为4.4毫摩尔。从培养箱中取出转染后的细胞培养物。

对培养瓶外部进行灭菌，并将培养瓶放入生物安全柜中。向培养物中加入已准备好的稀释培养基。转染后，将培养瓶转移回摇床培养箱中继续培养四到五天。

每天按照先前演示的步骤监测细胞活力。转染后第五至第六天，或当细胞活力降至50%以下时，应每天取等分试样用于蛋白质表达分析。通过以1000 × g离心细胞及其培养基5分钟收集细胞。收集含有分泌蛋白的上清液，并向HEK细胞沉淀中加入5 mL含10%次氯酸钠的溶液，按生物危害物处理弃置。

随后，从收集的上清液中纯化蛋白质。该表达系统可高效表达糖基化蛋白，如在HK293F细胞中瞬时转染后人IgG1 Fc的典型表达模式所示。使用蛋白柱对IgG1 Fc进行亲和纯化，或使用镍柱对带有组氨酸标签的GFP与Fcγ受体IIIa融合蛋白进行纯化，均可获得高纯度的蛋白质。

该系统在此二维核磁共振谱中高效表达了同位素富集的IgG1 Fc，该谱图关联了氢核与直接键合的酰胺氮的共振频率。观察到15N原子的信号分散良好。在不同培养条件下，使用HEK 293 F和HEK 293 S细胞产生了不同的糖型，基质辅助激光解吸电离质谱分析结果如图所示。

由HEK 293S细胞表达的IgG一条Fc片段，其携带的糖链为五分子甘露糖加两分子N-乙酰氨基葡萄糖的结构，不含岩藻糖。由HEK 293F细胞表达的材料中的糖链为复杂的双分支结构，具有核心岩藻糖，且多数以末端N-乙酰氨基葡萄糖为主，仅小部分为单唾液酸化或双唾液酸化形式。在使用HEK 293F细胞进行的表达过程中加入糖基化抑制剂，可使岩藻糖的掺入量减少超过90%。一旦掌握，瞬时转染的建立可在第一天耗时1.5小时，第二天仅需15分钟。经过四至六天的表达期后，含目标蛋白的溶液可在15分钟内完成收获。

最后，蛋白质纯化过程大约需要1.5小时。在进行该操作时，重要的是要记住在转染前维持稳定的细胞培养状态，转染时应使用处于活跃生长期的细胞，并在加入PEI之前先加入DNA。完成该步骤后，可采用多种生物物理技术对蛋白质进行功能表征，以研究该表达的糖蛋白在构建完成后的结构与功能。

该技术为免疫学领域的研究人员探索IgG的结构与活性关系及其在体外和体内糖基化的功能铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用K 2 93 F细胞与PZ N two载体组合来制备和纯化糖蛋白。