通过可诱导瞬时转染实现离子通道表达的可控调控

本实验的总体目标是提供一种便捷的方法，在异源表达系统中调控离子通道的表达，同时避免繁琐的细胞培养过程。从而为不同实验之间提供可控的条件，并获得更可重复的实验结果。该方法有助于推动离子通道领域的研究进展。

例如在药理学中表征通道特性。由于现有方法要么过于复杂，要么表现出不一致的蛋白表达水平。该技术的主要优势在于，我们能够在相对较短的时间内，实现多种蛋白的可控表达水平，且可根据具体实验需求进行定制。

开始此实验步骤时，将 TREX 293 细胞转移至已预先加入每孔 0.9 毫升完全 DMEM 培养基的 12 孔板中，以达到 50% 汇合度。在 37°C 的 CO₂ 培养箱中孵育细胞过夜。接下来，配制转染混合物，该混合物由 DMEM、目的基因（此处示例为 TRPV1）、一种惰性质粒以及脂质转染试剂组成。

进行电生理实验时，在转染混合物中加入含EGFP的哺乳动物表达质粒，以便观察成功转染的细胞。将转染混合物在室温下孵育30分钟。然后，用移液器将转染混合物逐滴加入12孔板中的细胞培养孔内，完成细胞转染。

剧烈震荡培养板，以确保DNA和转染试剂均匀分散。随后，将转染后的细胞在27摄氏度下孵育过夜。次日早晨，若进行电生理实验，可通过紫外灯下观察EGFP的荧光信号来确认细胞是否转染成功。

若进行电生理学实验，将细胞从12孔板转移至含500微升完全DMEM培养基的PDL包被的盖玻片上。若进行钙成像实验，则将约20,000个细胞接种至PDL包被的钙成像培养皿中。在此步骤中，用双蒸水配制浓度为1毫克/毫升的多西环素储备液。

将储备液在 4 摄氏度避光保存，可稳定长达三周。如需长期保存，应将多西环素储备液置于 -20 摄氏度。接下来，用完全 DMEM 培养基新鲜配制多西环素工作液。

并将其升温至 37 摄氏度。进行电生理记录时，向每个孔中加入 500 微升浓度为每毫升 2 微克的多西环素溶液，使多西环素的终浓度达到每毫升 1 微克。进行钙成像时，向每个孔中加入 100 微升浓度为每毫升 3 微克的多西环素溶液，使多西环素的终浓度达到每毫升 1 微克。

在37摄氏度、5% CO2条件下孵育样品，孵育时间根据诱导需求而定。为通过钙成像校准蛋白质表达，配制林格氏液并将其预热至37摄氏度。为促进AM酯类（如Fura-2等荧光离子指示剂）在水溶液中的分散，配制非离子型F-127在DMSO中的溶液。

将溶液加热至 27 摄氏度，直至非离子型 F-127 溶解。然后将非离子型 F-127 溶液在室温下保存，并在使用前再次加热至 37 摄氏度。随后，用 Ringer 溶液配制 Fura-2 AM 负载溶液，其中添加 2 至 3 微摩尔 Fura-2 AM、0.2 毫克/毫升非离子型 F-127 和 10 毫摩尔 D-葡萄糖。

然后吸去培养室中细胞的培养基，并替换为Fura-2 AM负载液。将细胞在室温下避光孵育60分钟。随后，吸去Fura-2 AM溶液。

用任氏液和10毫摩尔D-葡萄糖溶液洗涤细胞，以去除细胞外的染料。每孔中留200微升任氏液和10毫摩尔D-葡萄糖溶液，并在室温避光条件下孵育30分钟。

30分钟后，将腔室放置在显微镜物镜上方的载物台上，并用固定夹固定。然后根据最终所需浓度，计算并配制TRPV1特异性激动剂辣椒素的工作浓度。接着，打开光源、相机和显微镜，选择Fura-2滤光片，以检测510纳米波长的发射光。

通过调节显微镜旋钮，调整至所需的放大倍数，并对选定视野中的细胞进行聚焦。在暗环境下，扣除背景光并设置曝光时间。以所需的速率设置图像采样。

然后，通过在340纳米和380纳米波长下激发Fura-2负载的细胞，开始记录其荧光响应。340与380信号的比值可反映细胞内钙离子浓度，从而也可反映TRPV1的活性。随后，在200微升Ringer溶液中加入2微摩尔辣椒素，使最终辣椒素的饱和浓度达到1微摩尔，以评估TRPV1的表达水平并分析TRPV1的响应。

为了确定单通道记录的最佳诱导时间，首先配制浴液和移液管溶液。然后准备一些玻璃移液管，并通过火焰抛光使其电阻达到 10 至 12 兆欧。通过在目标细胞的膜上形成封接，进行全细胞膜片钳记录。

随后，将钳制电位设置为负40毫伏。通过施加负压使膜破裂。之后，使用显微操作器将带有膜片的移液管从细胞上提起。

然后将灌流系统置于含有膜片的移液管旁边。将贝塞尔滤波器和输出增益分别调至2到5千赫兹和10安培。随后，将激动剂的饱和浓度灌流到膜片上。

然后根据施加于细胞的诱导时间，分析成功记录的单通道膜片数量，并根据所需结果调整诱导时间。此处显示的是瞬时表达RTRPV1的TREX 293细胞在辣椒素处理前后的伪彩色图像。以下是经处理并转染的TREX 293细胞中胞内钙离子水平随时间变化的相应结果。

每个图表代表 50 个细胞的平均值。在 TRPV1 记录中，单通道膜片钳的成功率取决于诱导时间。以下是转染后瞬时表达 RTRPV1 的 TREX 293 细胞在诱导 2 小时和 4 小时后的膜片钳电流轨迹。

该图显示了在指定诱导时间后膜片中通道的数量。如果操作得当，该技术可在转染后的12小时内实现对可控表达蛋白的分析。在进行此操作时，重要的是要记住针对不同蛋白标准化转染浓度和诱导时间。

观看本视频后，您应能够充分理解如何以高效的时间控制方式，为您所选择的离子构建可控表达系统。