巨囊突触膜电容记录的膜片钳方法

大家好，我叫Ken Paradiso。我在位于美国国立卫生研究院贝塞斯达园区的国家神经疾病与卒中研究所院内计划项目中，为凌刚吴（Ling Gang Wu）工作。我将向大家演示用于杯状细胞的突触前记录膜片钳技术。

为了制备脑组织，我们首先将大鼠的脑取出。将脑组织放入此溶液中，该溶液需保持冰冻状态，为低钙溶液，并持续通入碳合气（carbogen）以确保脑组织始终获得充足的氧气供应。同时，溶液必须保持冰冻温度，以最大限度减少多巴胺（DA）的降解，从而减少组织损伤。

此时，脑组织将置于该溶液中。取出后，将其适当切割，以便放置在切片块上，用Sano胶或万能胶固定在切片块上，然后向切片室中充满冰冷的低钙溶液，通入气体进行鼓泡，将组织块置于振动切片机上，以70赫兹的刀片振动频率和0.01至0.02毫米每秒的前进速度，切割成厚度为180至190微米的脑片，即相当于每秒推进10至20微米。

每完成一个切片后，我们将切片从冰冷的生理盐水中转移至该切片室中，切片室含有正常钙溶液。该溶液与我们用于记录时所用的溶液相同，且维持在37摄氏度的生理温度。随后，我们将切片置于其中进行恢复。

在进行生理学实验之前，它需要在此溶液中放置半小时到一小时。现在我将把脑组织从溶液中取出。为了演示方便，这里使用的是一个较大的脑组织样本。

这是来自一只 P 20 大鼠。我们将它翻转过来。我们感兴趣的是脑干。

因此，此处下方的区域以及肾盂的保持位置就在这片区域附近。接下来，我们将切除其余的脑组织，分离出脑干，然后为切片室准备脑干。好的，我们将切掉其余的脑组织，仅保留脑干部分。

我将把它翻转过来，以展示目前的操作位置。通常情况下我们不会这样做，同样，我们可以直接去除整个这部分。再将其翻转回来，我们已经分离出了脑干，并准备在那里再进行一次切割。

好的，这就是脑干。Held氏卡利西体大约就在这儿和那儿。

这是脑干。同样，我们将它稍微向后推一点。接下来会切除一侧的小脑，这样脑干就能像这样侧向放置。

我们加入少量 Sano 丙烯酸胶，并保持其侧向放置，迅速用冷冰和低温低钙溶液填满。尽快将供氧管插入其中。现在将其拿起并转移到振动切片机上。

我们快速推进以到达脑部起始位置，一旦到达脑部起始位置，便将速度降至每秒 0.01 毫米。也就是每秒 10 微米，因此其移动速度极慢。

大脑的第一部分是包含 mtb 的区域，即斜方体旁正中核（medial nucleus of the trapezoid body）。这部分包含……好的，当我将样本移入移液管后，我会尽量使其靠近移液管的尖端。这是脑组织切片，我需要迅速将其转移至该记录用孵育槽中，槽内含有标准记录溶液，其中钙离子浓度正常，并维持较高温度。

这将使脑片在切片操作后得以恢复，为后续的生理学实验做好准备。好的，接下来的步骤将重复进行。以下是我将用于膜片钳实验的设备。

我们使用的是固定载物台的直立显微镜。正如我所说，载物台是固定的，因此显微镜通过一个操纵器在载物台下方移动。我们采用Wigs和Newman微操纵器来固定载物台，放大器的头部阶段则使用来自HECA的EPC 10膜片钳放大器。

此外，我还应提到的是，我们使用的是配备红外光源的微分干涉差（DIC）显微镜。因此，我们在这里配备了一台红外相机，因而在寻找CAE时，所有观察到的内容都会显示在屏幕上。膜片钳放大器由名为Pulse的软件控制，该软件同样由Heca公司提供，可控制放大器及整个生理学实验的运行。

结果将显示在此屏幕上。所持的神经末梢是一个较大的突触前终末，由于其体积较大，我们能够直接在其上进行膜片钳操作。因此，我们可以记录突触前电活动，这在中枢神经系统中是一种较为独特的技术。

因此，这使我们能够测量突触前激活的钙离子通道。此外，如果我们希望刺激通向巨大突触前末梢的神经，也可以测量动作电位活动。在本实验室中，我们所测量的是一个称为胞吐作用的过程，即含有神经递质的囊泡与细胞膜融合的过程。

现在，这些囊泡会通过一种称为胞吐作用的过程与细胞膜融合，从而向突触终末添加膜成分，我们可以通过电容的变化来测量这一过程。当膜成分被添加到终末时，电容会增加。因此，我今天将展示的实验是在突触前进行的电容测量，用于观察膜被移除时的情况。因此，膜不能持续增加，当然也需要移除一部分。

该过程被称为胞吞作用或膜摄取。我们也可以测量这一过程，其表现为电容水平的下降，稍后我们将展示相关示例。现在，这使我们能够监测钙通道的活性，同时监测参与胞吐和胞吞作用的一些蛋白质，并对它们进行研究。

我们可以加入一些肽类物质来阻断参与胞吐或胞吞作用的蛋白质，也可以使用具有相同作用的毒素。此外，我们还可以调节进入神经末梢的钙离子量，从而深入研究胞吐过程、神经递质的释放，以及随之发生的膜回收过程。

这是装有我们细胞内记录液的离心管。我们会提前配制好溶液，然后将其冷冻保存，通常可以在数周至一个月内使用，之后才需要重新配制新的溶液。同样，在即将开始记录前，您总会发现有一定量的灰尘颗粒或其他类型的杂质进入您的离心管中。

你可以选择两种操作之一。一种是将溶液取出后进行过滤，另一种是将其离心一分钟或两分钟，然后吸取上清液，留下含有碎片和其他物质的底部沉淀。我更倾向于采用离心法，现在我就进行这一步操作。

这是装有我们细胞内液的离心管，已经解冻。接下来，我们将它放入小型离心机中离心约两到三分钟，这样足以去除溶液中可能存在的较大灰尘颗粒。

现在，我只需小心地吸取上清液，也就是我们刚刚离心过的溶液，注意不要搅动，将其转移至一支干净的离心管中，大约吸取90%的液体。我再次尽量避免吸取最后的一小部分，因此就在这里停止。

我立即将其放在冰上，以确保在实验过程中保持低温。这一点非常重要。这是我们的移液器之一。

我们使用这种玻璃管进行细胞内记录。它由厚壁石英玻璃制成，外径为2毫米，内径为1.16毫米。首先，我们会对移液管进行后向填充。

因此，我们施加负压，将移液管插入记录液中，通过抽吸使移液管最尖端充满液体，否则无法以其他方式充满该部分。完成此步骤后，再取一根毛细管，从移液管后端将电极其余部分充满。这是一种标准的生理学技术，实际操作中需要轻轻弹击。

你有折断移液管尖端的危险，但如果你不这样做，往往会产生气泡。好的，现在我们将它放入移液管架上，移液管架连接到膜片钳放大器的头部支架。那里有一根氯化银导线。

银氯化物导线与细胞内溶液接触，从而能够测量突触前末梢的电活动。因此，我们的操作是找到含有大量CAEs的脑片，我们希望CAEs的密度较高。

因此，我们正在寻找斜方体的内侧核（MNTB），也就是形成卡利西终末（calyx）的部位，即卡利西突触所在的位置。我们的操作是开始在切片中进行扫描。例如，这里有一个位于表面稍深处的卡利西，由于没有合适的位点可供膜片钳记录，因此我们继续在切片上扫描。

因此，我们要取的是这里的萼片。我在屏幕上做了两个标记，表示移液管将要到达的位置。你可以看到，我将要吸取的那块萼片，移液管会向下移动。

我将施加正压，使其向上推动肾小盏，然后解除正压。此时肾小盏会向上贴附至移液管，就在这一瞬间，我将施加非常轻微的负压，尝试通过吸力和推力使膜贴附或密封到移液管尖端。好的，正压已解除。

现在我将施加负压。这里我们正在施加一个五毫伏的脉冲，或者确切地说是一个四毫伏的脉冲。好的，就是这样。好了。

现在我们将膜电位钳制在负80毫伏，消除快速瞬时电流。接下来我们将进行全细胞记录。我将施加轻柔的负压，尝试形成全细胞封接。

这些充电瞬变表明，他现在实现了移液管与细胞的连续接触，获得了全细胞记录。这是另一个漂亮的图像。其中较浅的红色是电容轨迹，你可以看到它突然上升，然后逐渐下降。

好的，我刚刚向您展示了从巨球状突触前终末获取记录的基本技术。我向您演示了如何制备包含斜方体旁正中核的脑片，巨球状突触就位于该核团中。

我已经向您展示了如何浏览切片。您需要逐一检查每一张切片，寻找表面具有最多壶腹（caly）的那张切片。然后，在该切片中寻找尽可能大的壶腹膜，并在其上进行膜片钳记录。

我还向您展示了膜片钳记录技术，这些是标准的膜片钳记录技术。