利用阿米巴作为宿主系统检测细菌毒力

首先将阿米巴原虫与来自单一毒力细菌分离株的突变菌株进行共培养。

变形虫吞噬细菌，模拟宿主免疫细胞的吞噬活性。

弃去培养基，并用新鲜培养基洗涤以去除胞外细菌。

加入含有抗生素的培养基并孵育，以杀死残留的胞外细菌。

用新鲜培养基洗涤，然后加入添加了抗生素的培养基。接着加入热灭活的饲养细菌，随后进行培养。

变形虫吞噬饲料细菌以获取营养。

孵育期间，有毒力的突变菌株在变形虫内存活并分裂。

接着，加入去垢剂溶液并孵育，以裂解阿米巴细胞，释放胞内细菌。

将裂解液点样于琼脂培养基上，用无菌水稀释，然后孵育。

突变细菌菌株形成的菌落在琼脂表面出现。

不同突变细菌菌株间菌落数量的差异表明其在阿米巴原虫细胞内存活与复制能力存在差异，从而反映出毒力的差别。

首先，在75平方厘米的组织培养瓶中，于室温下用30毫升蛋白胨酵母葡萄糖培养基培养棘阿米巴（Acanthamoeba castellani，简称AC）。一小时后，使用25毫升移液管去除上清液，并每次用10毫升不含碳和氮的AC缓冲液洗涤细胞，共洗涤三次。最后一次洗涤后，通过一次剧烈振荡使阿米巴从培养瓶底部脱落，然后在Falcon管中用新鲜AC缓冲液将细胞浓度调整至每毫升5×10⁵个阿米巴。

在96孔板中每孔接种5 × 10⁴个阿米巴原虫，将培养板置于32°C条件下静置孵育1小时，使悬浮的阿米巴滋养体贴附于孔壁。同时，将细菌置于冰上预冷，在孵育结束时向每孔加入5 µL解冻后的细菌。

在32摄氏度下孵育1.5小时后，在生物安全柜中将培养板倒置，弃去上清液，使液体流至无菌金属托盘中的无菌纱布堆上；每孔用200 µL新鲜AC培养基洗涤三次。最后一次洗涤后，每孔加入含阿米卡星的20 µL新鲜培养基，继续孵育共2小时，以清除任何残留的胞外分枝杆菌。

随后用新鲜的AC培养基洗涤三次，方法如前所述。然后，向每个孔中加入200 µL培养基，并添加新鲜的阿米卡星，接着加入5 × 10⁷个热灭活的大肠杆菌（Escherichia coli）。48小时后，每孔加入10 µL 10%十二烷基硫酸钠，在32°C下裂解细胞30分钟，取5 µL裂解液接种于含5%羊血的哥伦比亚琼脂平板上。

通过在每滴裂解液中加入 25 微升无菌水进一步稀释。当所有裂解液均接种完毕后，用塑料封口膜密封培养皿，并在 37 摄氏度下培养 3 至 4 天。当培养皿上出现菌落时，拍摄培养物照片，并通过细菌菌落数量最少的沉积物鉴定出胞内生长缺陷的突变株。