用于测定与哺乳动物细胞相关的细菌活力的荧光显微镜方法

该荧光显微镜实验用于评估与宿主细胞相关的单个细菌的活力，并确定细菌在不同亚细胞位置中的存活状态。首先，为了识别外部细菌，将感染的细胞暴露于一种针对细菌通透酶的荧光试剂中；在存在可区分活菌与死菌的荧光染料的情况下，根据细菌膜的完整性判断其活力。然后，为了指示细菌在宿主细胞内的定位，将感染的细胞与荧光标记的抗体共同孵育，该抗体针对特定的目标标志物。

获得的免疫荧光图像可用于确定宿主细胞内和细胞外存活细菌的比例，以及存活与非存活胞内细菌的亚细胞定位。与菌落计数实验、庆大霉素保护实验和电子显微镜技术不同，该方法能够直接评估单个细菌的存活状态，还可揭示位于不同亚细胞区室中的细菌是否存在存活能力上的差异。

演示该实验步骤的是我实验室的研究生 Brittany Johnson。在 24 孔板中培养于圆形玻璃盖玻片上的细胞中加入目标细菌，于所需时间孵育。轻柔冲洗感染后的细胞一次。然后加入 Alexa Fluor 647 标记的抗体或细菌特异性凝集素，用于检测胞外细菌，在室温避光条件下孵育 10 分钟。

经过两次洗涤后，吸去培养基，加入含有细胞素九和碘化丙啶的0.5毫升活死染色溶液。将细胞在室温下避光孵育15分钟，然后在MOPS氯化镁溶液中洗涤两次。将盖玻片倒置在载玻片上。

用透明指甲油封片。使用荧光显微镜及文本方案中所述的滤光片组，在30分钟内获取图像以标记细菌。在mors定义培养基中加入10微克/毫升的DPI，避光室温孵育20分钟。

现在用DPI标记的细菌感染贴壁细胞。不要用醛类或有机溶剂固定细胞。洗涤细胞一次。

然后加入 Alexa Fluor 647 偶联的抗体或凝集素，在室温避光条件下孵育 10 分钟。用 mops 缓冲液冲洗两次后，加入 Alexa Fluor 555 偶联的针对目标亚细胞标志物的抗体，室温避光孵育 20 分钟。再次用 mops 缓冲液冲洗两次后，用含氯化镁的 mops 缓冲液洗涤细胞一次。吸去培养基，加入 0.4 微摩尔的 cyt green，室温避光孵育细胞 5 分钟，然后用含氯化镁的 mops 缓冲液洗涤细胞两次。

然后洗涤细胞，再用 MOPS 氯化镁溶液洗涤一次，持续五分钟。将盖玻片倒置在载玻片上，用透明指甲油封片，并在荧光显微镜下于30分钟内获取载玻片的图像。

在本实验中，人中性粒细胞被淋球菌感染。Alexa Fluor 647 标记的大豆凝集素用于检测细胞外的淋球菌。随后，在含有皂苷的情况下加入绿色荧光活力染料和红色荧光碘化丙啶，皂苷可螯合胆固醇，优先穿透宿主细胞的质膜，但不会穿透感染细胞中淋球菌的膜。真核细胞核可同时被这两种染料染色。

这些淋病奈瑟菌感染的中性粒细胞图像使用了活力染料 Cyt Talk Screen 和 DPI 生成。未使用碘化丙啶染料，因为它在荧光显微镜的红色和紫外通道均会产生荧光。所有淋病奈瑟菌均可被 DPI 染色，但仅细胞膜受损的细菌可被 Ox Green 染色。

无活力的胞内细菌周围可见 CD63 染色形成的环状结构，该环状结构表明初级颗粒在该吞噬体中富集。有活力的胞内细菌则无 CD63 染色，表明其吞噬体中未富集初级颗粒。已采集。

综合这些数据表明，淋病奈瑟菌的存活能力与其存在于初级颗粒阴性吞噬体中的宿主细胞之间存在相关性。观看本视频后，您应能充分理解如何评估细菌在宿主细胞内的存活能力。此外，您还能够通过使用针对这些亚细胞区室的特异性抗体，确定定位于宿主细胞不同区室中细菌的存活状态。