从宏基因组文库中筛选生物采矿纤维素酶活性的高通量筛选方法

本实验的总体目标是从宏基因组文库中鉴定出表达纤维素酶的克隆。首先利用机器人复制已构建好的宏基因组文库，随后将复制后的文库在37°C条件下孵育24小时。然后检测大肠杆菌（E. coli）克隆的生长情况，并向复制的文库中加入裂解缓冲液和底物。

最终，可以通过使用酶标仪进行比色吸光度测定来获得显示纤维素酶活性的结果。大家好，我是来自不列颠哥伦比亚大学微生物学与免疫学系Steven Hallam实验室的Keith。今天我们将向您展示一种用于宏基因组文库高通量功能筛选的实验方法。

我们在实验室中采用此方法研究宏基因组文库中的纤维素酶活性。现在开始操作。在启动本方案之前，请准备好以384孔板形式储存的宏基因组文库。

本研究采用PCC单拷贝对照SMID载体，并结合Farge T一抗性TRANSFECT max EPI 300 T一抗性大肠杆菌细胞作为文库宿主以启动该实验流程。将含有文库的平板从-80°C取出，在37°C下解冻约20分钟。同时，使用QIX 2上的紫外光灭菌功能对机器人进行15分钟的灭菌处理。按照制造商说明设置Q fill 3系统，将培养基瓶通过无菌管路连接至多通路装置并进行程序化配置。

使用 Q fill three 加入适量培养基，并设置其填充体积为 45 微升。在每个孔中，利用机器人的排空功能排出管路和多通管路中的空气，直至观察到培养基流出。通过 Q fill three，利用多通管路的每个针头向所需数量的平板中加入 LB 培养基。

每块平板填充约需 20 秒。接下来，将文库板和新平板放入 Q 筛选仪的相应区域。通过机器人将适当的试剂加入清洗浴中。

后浴使用2%micro 90，中浴使用高压灭菌的蒸馏水，前浴使用80%乙醇。使用qix two的复制程序，选择合适的针头，以及源板和目标板的数量与类型。同时设置针头在每次复制间的清洗步骤。

通常每个浴槽运行六个循环即足够。该设备每次可处理10块板。设置机器开始运行。

复制过程大约需要15分钟。使用384针头进行全容量点样。点样完成后，将平板置于湿度盒中，在37摄氏度下培养24小时。

较长的孵育时间是必要的，因为加入阿拉伯糖会诱导产生高拷贝数的 smid。同时，按照书面实验方案所述清洁 Q fill three 机器人。孵育结束后，从 37 摄氏度的培养箱中取出培养板。

将盖子放在一旁，并将培养板放置在快速堆叠装置附带的杂志加载平台上。务必记录好培养板的顺序，因为软件不会自动记录。堆叠底部的培养板将被读取。

首先，从快速堆栈中取出一个载片架。确保其为空，然后将其推入待读取的载片堆栈中。握住载片架的手柄，载片应自动加载到载片架内。

将弹匣以正确方向装入快速堆叠装置中。在连接的计算机上打开其扫描程序，选择新建会话并为其命名。

选择平底384孔板作为板类型。在板布局区域中输入。点击向导按钮，并选择将384个未知样本添加到板中。

在方案区域中，选择“孔循环”选项，并设置为 384 个孔。屏幕左侧的流程树中将出现一个孔循环图标。选中该图标，然后点击以添加光度测量步骤。

将其设置为在 600 纳米波长处读数。使用唯一的名称保存该检测程序，并关闭扫描仪的程序。然后打开 polara RS 程序。

在主页面上，有一个表格列出了连接到快速堆叠设备下的 VARI 扫描标题中的仪器，点击运行会话选项。随后应出现一个检测窗口，中间带有流程图。选择运行会话项，然后找到已保存扫描的名称。

在屏幕右侧出现的下拉菜单中重新运行。选择方案后，点击运行。此检测将弹出一个对话框，询问使用哪个进样盒作为来源，以及哪个进样盒为空。

屏幕上的下方盒子对应前部杂志架。确保快速堆栈和Vario扫描均已开启，然后点击开始。快速堆栈将自动把板加载到板式读数仪中，从而实现对板的连续测量。

观察第一块板加载到Vario扫描仪中，以确保仪器正确对齐以便读取。扫描25块板大约需要50分钟。Barrios扫描完成后，取出完整的板架，并将其放置在板架加载平台上。

抬起平台的外侧矩形部分，培养板架应随之滑出，使培养板留在中央堆叠直立。最后，将培养板盖子重新盖好，用于基于溶液的筛选实验。对于纤维素活性检测，首先使用预配制的10倍裂解液浓缩液配制检测反应混合液。

按照书面实验方案所述，加入 pH 5.5 的 50 毫摩尔/升醋酸钾缓冲液。然后在 DMSO 中配制浓度最高为 75 毫克/毫升的显色底物 DIPHENYL 或 DNP 细胞杀菌剂，确保底物完全溶解。将 DNP 细胞杀菌剂储备液加入检测反应体系中，使其终浓度为 0.1 毫克/毫升。

请注意，每块板大约使用 20 毫升溶液，另需额外 50 毫升溶液以留出死体积。按照之前的方法设置 Q fill three，使用 Q fill three 将检测混合液加入每块板中。每块板的填充时间约为 20 秒。

加入检测混合液后，将酶标板在37摄氏度孵育12至16小时。在湿盒中，从37摄氏度培养箱中取出酶标板。将盖子放置一旁，以与之前相同的方式将酶标板放置到快速堆叠装置附带的载片加载平台上。

打开扫描其重新程序，并按照之前的方法进行设置，但光度测量应设置为在 400 纳米处读数。然后将参数输入 POLARA RS 程序中，如先前所示。

让 Vario 扫描仪读取酶标板。运行结束后，取出并妥善处理酶标板。要导出吸光度读数，请打开扫描仪配套软件并进行选择。

打开一个现有文件。选择会话保存的目录，点击加号图标以展开列表。在标题下方将显示从容器一到容器 N 的选项。根据培养板的数量，在页面顶部的菜单栏中选择要分析的第一块培养板，然后选择数据报告导出。

选择导出选项，例如板布局和光度数据。点击查看报告，然后点击文件保存。选择所需目录。

输出格式为 Microsoft Excel 电子表格。此处显示了来自一个 384 孔板的吸光度读数，该孔板中含有一个阳性克隆，如图所示，与不表达纤维素酶活性的克隆相比，阳性克隆的吸光度显著增加。

检测时间、孔的位置、酶标板上的位置或DNP浓度的差异均可能影响绝对吸光度读数。相对吸光度读数，例如高于酶标板平均值或列平均值的吸光度差值，是鉴定纤维素酶阳性克隆更为可靠的方法。我们刚刚向您展示了如何从宏基因组文库中鉴定纤维素酶阳性克隆。

进行此操作时，重要的是要记住将DNP细胞生物侧溶解于DMSO中，并将培养板置于湿化孵育箱中孵育。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。