在烟草植物中表达来自Trichoderma reesei的重组纤维素酶Cel5A

以下实验的总体目标是在烟草中瞬时表达目标蛋白，以在较短时间内评估基于植物表达酶的可行性。该瞬时表达通过农杆菌菌株侵染烟草叶片来实现，该菌株含有插入目的基因的载体，作为第二步操作。在培养后，收集侵染的植物叶片，并对蛋白提取物进行部分纯化，以获得可使用的酶溶液。随后进行蛋白质分析，以评估基于植物表达对酶的影响，并验证其酶活性。

通过 Western 印迹、zymography 及底物降解实验获得的结果可显示蛋白质大小、可能的糖基化效应及其酶活性。该方法有助于回答有关植物生物质转化的关键问题，同时也能提供瞬时表达于烟草中的酶活性信息。该方法的可视化演示至关重要，因为渗透步骤较难掌握，叶片容易被注射器或操作不当所损伤，且实验需在无菌条件下进行。

将农杆菌的单菌落转移至含有10毫升添加抗生素的酵母提取物肉汤的锥形瓶中。然后在26°C、180 RPM振荡条件下培养接种后的肉汤36至40小时。接着，将每种菌液200 µL接种到20毫升含有相同抗生素的酵母提取物肉汤中，并在相同条件下继续培养36至40小时。

向培养物中加入两微升苯乙酮、100 微升 40% 葡萄糖溶液和 200 微升 pH 5.6 的 1 摩尔 MES 缓冲液进行诱导，并继续过夜培养。现在从温室中取出植株，用移液器吸头在植株顶部第三至第五片叶的 AB 轴侧面轻轻划伤，以利于渗透。然后用渗透培养基填充注射器，并将其置于先前制作的其中一个切口处。

用手指支撑住轴向叶侧的注射器，小心地将培养基注入叶片的静脉内区域。为观察表达TR细胞5:00 AM樱桃荧光蛋白的叶片部位的荧光，需使用便携式绿色光源照射植株。通过红色滤光片观察时，TR细胞5:00 AM樱桃的荧光将清晰可见。

为了提取表达的蛋白质，选择已用含有P track ERTR细胞五A的AUM侵染的烟草叶片，并将其切成每片一克的小块。接着，将叶片放入预冷的研钵中，并向样品中加入适量液氮。用研杵将叶片研磨成粉末状。

使用未侵染的烟草叶片重复该过程以获得对照样品。然后向研磨后的叶片材料中加入含有1毫摩尔苯甲基磺酰氟的2毫升PBS，混匀直至大部分叶片材料呈悬浮状态。将提取物在4摄氏度下以15,000 ×g离心20分钟。

然后弃去沉淀，通过将含有 S natin 的蛋白质在 55 摄氏度下孵育 10 分钟来部分纯化 TR 细胞五 A，并在室温下静置 10 分钟。随后将 SNAT 在室温下以 15,000 ×g 离心 10 分钟。弃去沉淀，将含有 snat 的蛋白质用于所有后续实验。

其他检测。对未侵染的植物也进行部分纯化处理，以获得对照样品。在此步骤中，将乙基纤维素与水混合，配制成1.5%的溶液，并在搅拌条件下孵育至完全溶解。

制备A-C-M-C-S-D-S聚丙烯酰胺凝胶时，在10毫升SDS聚丙烯酰胺凝胶混合液中用1毫升1.5% CMC替代1毫升水，然后正常倒入凝胶。接下来，将样品在含有SDS的条件下煮沸以使其变性。在200伏电压下电泳50分钟，直至染料前沿迁移至凝胶底部。随后在15% C-M-C-S-D-S聚丙烯酰胺凝胶中进行蛋白质原位复性。

使用 pH 6.5 的 20 毫摩尔磷酸柠檬酸缓冲液中含有 1.5% β-环糊精的溶液。将凝胶在此溶液中于室温下轻轻振荡孵育 15 分钟。弃去 β-环糊精溶液，用室温水短暂漂洗凝胶，再置于 pH 4.8 的 50 毫摩尔醋酸钠缓冲液中孵育 15 分钟。

然后，将复性后的15% C-M-C-S-D-S聚丙烯酰胺凝胶置于30毫摩尔/升醋酸钠缓冲液中，在50摄氏度下孵育20分钟，进行CMC酶解实验。为观察CMC降解的位置，使用0.1%刚果红溶液染色10分钟，随后用1摩尔/升氯化钠溶液脱色30分钟，或直至出现清晰条带为止；最后用0.3%乙酸溶液洗涤凝胶。为获得更清晰的成像效果，在进行检测前立即配制4 MUC的2倍工作液，将100微升4 MUC工作液分别加入96孔板的不同孔中。

然后，将每种样品各100微升加入相应的孔中，每份样品设三个复孔，使用360纳米的激发波长和465纳米的发射波长进行检测。通过荧光光谱法测定四甲基伞形酮（4-MU）荧光的零分钟时间点。接着，将酶标板用粘性封板膜覆盖后，在50摄氏度下孵育20分钟。

随后，通过冷冻终止反应。然后，使用与零分钟时间点相同的参数测定终点的μ荧光。从20分钟时的荧光值中减去零分钟时的荧光值，以确定在开始检测前由酶活性引起的荧光变化。

制备 A-O-C-M-C 两倍工作液。然后在 1.5 毫升离心管中加入 50 微升样品和 50 微升工作液。接着，将样品在 50 摄氏度下孵育 20 分钟。

加入250微升沉淀溶液以终止反应。随后，将每个样品剧烈涡旋振荡10秒，以确保样品与沉淀溶液充分混合。然后在室温下孵育样品10分钟，再次涡旋振荡，随后在1000 G下离心10分钟。

随后，将每个样品中的 200 微升上清液转移至 96 孔板中，注意不要扰动沉淀。沉淀中的酶活性通过可溶性染料的较高水平来显示。使用分光光度法在 590 纳米波长下测定该值。

在此步骤中，将滤纸圆片放入1.5或2毫升离心管中。向滤纸圆片加入100 µL 60 mM乙酸钠溶液和100 µL样品，在50 °C、300 rpm振荡条件下孵育20小时。

此外，在进行检测前立即设置不加滤纸的单个样品作为对照。配制1.5倍浓度的PABA工作液，包含1毫升PBA溶液A和9毫升PABA溶液B，冰上保存备用。接着，将样品置于0.5毫升耐热管中进行准备。

样品由45微升水、5微升与滤纸共同孵育的每种溶液以及100微升PABA工作溶液组成。随后，运行以相同方式制备的样品对照和五个标准品。然后在100摄氏度下准确孵育样品、对照和标准品10分钟，再于室温下冷却10分钟。

取100微升溶液加入96孔板中，用分光光度计在410纳米波长下进行测定。用滤纸样品的数值减去相应样品对照的数值，以确定所释放的还原糖量。以下是显示表达盒以及烟草植物中蛋白表达情况的图片。

这是在正常光下以及在带有红色滤光片的绿光下观察到的瞬时转化烟草叶片的表型，其中TR细胞5:00 AM樱桃蛋白的表达由明显的红色显示。SDS-PAGE凝胶、Western印迹以及CMC纤维素酶活性染色图展示了T细胞五A蛋白的大小和活性。总可溶性蛋白已通过考马斯亮蓝染色进行分离和可视化；针对T细胞五A蛋白组氨酸标签的Western印迹进一步确认了其蛋白大小，此外，通过刚果红染色的纤维素琼脂糖凝胶显示出其对CMC的纤维素酶活性。此处显示的是在烟草叶片中瞬时表达TR细胞五A蛋白后，经热沉淀纯化前后的总可溶性蛋白，其中TR细胞五A蛋白为最明显的条带，并且在Western印迹和CMC活性染色图中均可观察到。

我们还观察了未经过热沉淀处理的烟草植物中的总可溶性蛋白质，以及市售的纤维素酶混合物中的蛋白质。该图显示了TR细胞五号A的酶活性定量结果：将TR细胞五号A与4-MUC、偶氮羧甲基纤维素（Azo-CMC）或滤纸共同孵育，通过检测荧光素4-甲基伞形酮（fluoro four four mu）偶氮染料的释放，或通过测定PBA显色反应中还原糖的生成量来评估底物降解情况。按照此方法，还可采用其他技术如蛋白质定位分析，以进一步了解蛋白质的亚细胞定位对酶稳定性和活性的影响。

观看本视频后，您现在应已清楚了解如何在烟草中瞬时表达蛋白质，以及掌握一些评估酶活性的良好知识。用于纤维素生物质转化。