酵母菌落包埋法

本实验的总体目标是包埋酵母菌落。该过程首先从琼脂平板上取下菌落及其下方的琼脂，将其置于数滴熔融琼脂的液滴上，并迅速用更多熔融的琼脂覆盖。随后修去菌落周围多余的琼脂，使其足够小以放入模具中。

随后将嵌入的AER菌落进行固定、染色、脱水，并最终用spurs树脂浸透。将样品块置于模具中，加入额外的spurs树脂，孵育至完全硬化，然后进行切片。最终可通过光学显微镜或电子显微镜观察酵母菌落内细胞类型的分布情况。

与现有的扫描电子显微镜等方法相比，该技术的主要优势在于能够确定菌落的内部结构。该方法有助于回答微生物发育领域的一些关键问题，例如菌落内细胞类型的分布情况。该方法为了解藏黄链霉菌（croce CAC）菌落的结构提供了见解，但其也可能适用于其他微生物。

该方法的可视化演示至关重要，因为仅通过书面方案可能难以掌握菌落的处理与包埋技术。本方法的构思源于我们于2002年发表的一些遗传学数据，这些数据表明孢子在菌落中的分布并不均匀。我们借鉴了Fin实验室中Engelberg建立的菌落切片方法，并对其进行了改进。

现在开始操作。首先将野生型酿酒酵母在30摄氏度的琼脂平板上培养，直至平板上出现约300个菌落。使用窄 spatula 逐个从平板上挑取直径为1至2毫米的菌落。

然后使用1毫升移液器吸头，将数滴42摄氏度的2%琼脂滴加到显微镜载玻片上，并立即在琼脂凝固前将菌落正面朝上放置于琼脂上。再向菌落上滴加数滴琼脂，静置使其凝固，确保整个菌落（包括菌落顶部）完全包裹在琼脂中。在后续所有实验步骤中使用剃刀刀片进行操作。

修剪菌落周围的琼脂块，并将含有菌落的琼脂块放入一个含有2%多聚甲醛和2%戊二醛固定液的3.5毫升硼硅酸螺口小瓶中。菌落必须逐个处理，以防止干燥，但最多可将10个菌落置于同一小瓶中。将菌落在4°C下放置七天。

一周后，去除固定剂，用约 1.5 毫升 0.15 摩尔的钠溶液在 pH 7.2 条件下将农杆菌菌落清洗两次，每次清洗后置于冰上孵育 15 分钟，不进行震荡。随后再重复清洗两次。

使用1.5毫升一倍浓度的OS缓冲液（含100毫摩尔/升磷酸二氢钾、10毫摩尔/升氯化镁，pH 6.0），每次洗涤后于冰上孵育5分钟。接下来，使用同一离心管，进行此处及本实验方案文字部分列出的锇处理及洗涤步骤。然后，再次使用同一离心管，在第二天清晨尽早完成此处及配套书面方案中列出的梯度脱水步骤。

按此处及随附的书面方案制备spurs试剂。立即用1.5毫升100%室温乙醇对agri块进行五次洗涤，每次10分钟。最后一次乙醇洗涤后，仅去除足够的乙醇，使agri块仍被覆盖。

使用移液管，向小瓶中加入约 0.5 毫升的 Spurs 试剂，在轮转仪上低速旋转 15 分钟。室温下旋转结束后，静置小瓶 30 分钟。随后，完全移除溶液。

然后加入 1.5 毫升 Spurs 试剂以覆盖琼脂块。再次将离心管置于旋转轮上，在室温下旋转 15 分钟，静置 30 分钟。重复此洗涤步骤。

重复上述步骤三次。最后一次30分钟结束后，移除SPURS试剂，并加入新鲜的SPURS试剂以覆盖组织块。让凝胶块在室温下静置4小时。

更换Spurs试剂并旋转过夜。次日早晨，再次更换Spurs试剂，并使离心管持续旋转至次日。次日早晨，将Spurs试剂加入编号的硅胶模具中，用量以刚好覆盖模具底部为宜。

接下来将琼脂块放入模具中，在60摄氏度下孵育4小时。4小时后，向模具中补充更多的琼脂、试剂，并在60摄氏度下继续孵育过夜。孵育结束后，从模具中取出琼脂块用于切片。

此处展示了一张通过野生型酿酒酵母菌落中心部分的光学显微照片。该酵母菌株为从树木渗出物中分离得到的野生型菌株。菌落在切片前于YNA培养基中培养六天。

在此图像中，阿萨伊酵母、假丝状酵母和卵圆形酵母易于区分，菌落侵入下方琼脂的区域也清晰可见。开放箭头指示典型的阿萨伊酵母，实心箭头指示典型的卵圆形营养细胞，实心箭头指示拉长细胞链及SI。该图像为实验室酵母菌株SH 1 0 2 0和W 3 0 3背景下的薄切片透射电子显微照片示例。

该菌落在切片前于YNA培养基中培养了六天。图像显示菌落中一个含有高频率孢子细胞的区域。箭头指示孢子壁的双层结构。

在A部分中，我们展示了一个四天菌落的区域，其中B部分的图像上叠加了一个由15个矩形组成的网格。每个矩形中与孢子相关的细胞出现频率以柱状图形式表示，15个柱子对应A部分所示的15个矩形。数据来自四个独立培养四天的菌落，取均值及标准误。在C部分中，展示了四个独立培养八天菌落的均值及标准误。一旦掌握该技术，可在两周内完成，包括一个完整工作日及数个一至三小时的工作时段。在进行该操作时，需注意立即加入溶液，以防组织块干燥。完成该操作步骤后。

其他方法，例如免疫电子显微镜技术，可能用于确定特定蛋白质表达细胞在其发育后的分布情况。该技术使我们不仅能够观察孢子化细胞的排列模式，还能观察克鲁兹假丝酵母（croce CCI）菌落中假菌丝细胞的排列模式。观看本视频后，您应能够充分理解如何包埋酵母菌落以进行切片。

请务必注意，本实验方案中使用的许多显微镜试剂可能具有极高危险性。请务必使用通风橱，穿戴防护服，并妥善处理试剂。好了，就这些。

感谢观看。祝您的实验顺利。