冷冻切片酵母群落以观察荧光模式

以下实验的总体目标是制备酵母群落的横切面，以观察群落内不同荧光标记细胞群体的空间分布情况。首先通过冷冻群落，并使用甲醇固定，以保存细胞在群落中的空间分布状态；第二步，蒸发甲醇，以便包埋剂OCT化合物能够充分渗透。

随后将包埋的群落进行冷冻，以备冷冻切片。接下来，使用冷冻切片机对群落进行切片。该群落及其横截面可在荧光显微镜下成像，获得的结果可显示群落内荧光标记细胞群体的空间分布情况。

与现有的光学切片等方法相比，该技术的主要优势在于能够揭示这些群落内部深层区域的种群空间分布。开始此操作时，需在膜滤膜上培养酵母群落。本方案对应的是在直径为六毫米的膜滤膜上培养的典型群落，其细胞数量少于两乘以十的八次方个，随后将其置于负二十摄氏度的冰箱中。

为了更好地保留荧光，使用一片直径为一厘米的沃特曼 541 滤纸覆盖在孔的底部。该滤纸在后续步骤中作为载体用于转移菌群。向孔中加入一毫升 -20 °C 的 100% 甲醇，并将孔置于 -20 °C 环境中，使温度达到平衡。随后，用镊子夹取带有菌群的膜滤纸浸入液氮中至少 15 秒，以冷冻酵母菌群。

接下来，将冷冻的样品转移至含有甲醇的、温度为负20摄氏度的容器中。冷冻机中的甲醇可确保样品保持水平状态。将其浸入甲醇后等待20分钟，膜滤器将开始在甲醇中解体。

20分钟后，将带有群落的沃特曼滤纸从甲醇孔转移至一个保持在零下20摄氏度的冷培养皿中。转移时，确保群落始终位于载体沃特曼滤纸的上方。在放入冷培养皿前，用另一块厚沃特曼滤纸吸去多余的甲醇液滴。

这将确保样品间甲醇挥发时间的一致性。等待四到六小时，使甲醇完全挥发。在适当的时间结束挥发过程对于本实验步骤的成功至关重要。

为避免样品过度干燥，在甲醇蒸发过程中需定期检查酵母群落的状态。制作一个足够大的长方体铝箔容器，使样品与容器每侧的距离至少约为两毫米。在容器底部加入一滴OCT，以确保样品四周均被OCT包围。

当蒸发完全后，将样品从负20摄氏度的冰箱中取出。剪去滤纸上未被酵母群落覆盖的部分。此步骤需迅速完成。

为避免样本过度干燥，将组织置于铝箔容器的底面，并立即用OCT包埋剂覆盖样本，使OCT高度高于组织高度3至4毫米。静置10分钟。

最后，将包埋在OCT中的样品置于干冰上的金属板中，于零下20摄氏度或零下80摄氏度冷冻保存冻存的群落。为准备切片冻存的群落，将冷冻切片机切片室的温度设置为零下25摄氏度。将样品留在切片室内，直至其温度与切片室温度达到平衡。

然后从样本上去除锡箔，并切去多余的OCT包埋剂。在冷冻载具上滴加一滴OCT包埋剂，将样本固定于冷冻载具上。在样本侧面暴露的沃特曼滤纸处均匀涂抹OCT包埋剂，使其厚度达到两到三毫米。

确保样本四周的OCT包埋剂边缘保留2至3毫米，有助于维持切片的完整性。在切片前，应先让OCT在冷冻切片机舱内完全冻结。使用OCT样本块的侧面来对齐样本与刀片的相对位置。

如果样品相对于刀片未对准，切片将从样品的某个角或侧面开始。调整样品台，确保刀片切割样品块时形成完全垂直的切面。酵母群落的典型切片厚度约为 14 微米。

切下组织片后，使用室温放置的载玻片收集组织片。将载玻片缓慢移向切下的组织片，组织片会融化并转移至载玻片上。每张载玻片最多可转移18个组织片。

将切片储存于低温环境中，最好在成像前保存于负20摄氏度。若需最大程度保留荧光信号，可在4摄氏度下保存一周，信号损失最小。切片后应立即进行成像。

此处展示的是在相同条件下培养的酵母群落垂直横截面的代表性荧光图像。该群落由两种带有荧光蛋白标记的嗜光型visier菌株组成，其中M cherry显示为红色，Y-E-G-F-P显示为绿色。由于对包括空间在内的共有资源的竞争，其垂直横截面呈现出柱状模式。

在横切面中可分辨出单个细胞的分辨率。该图比较了使用甲醇固定的横切面（如底层面板所示）与未使用甲醇固定的横切面（如顶层面板所示）。未固定的群落切片中荧光信号得以保留，但群落的完整性受到破坏。

因此，部分细胞会从切片边缘漂浮脱落，导致整体得率低于固定后的群落。甲醇固定可使群落细胞保持聚集，但会引起细胞收缩，表现为群落高度降低。该图展示了由两种携带 DS RED 和 YFP 荧光蛋白的 visier teed Protopic 菌株组成的酵母群落的代表性明场和荧光垂直截面图像。

群落顶部的细胞形成一个与母细胞明显不同的冠状结构，在明场下表现出更强的散射光和更亮的荧光。这些模式与已报道的酵母菌落分化模式一致。观看本视频后，您应能充分理解如何利用冷冻切片技术来观察酵母群落内部的荧光空间分布模式。