小鼠胰岛分离

您好，我是 Greg Zott，来自加州大学旧金山分校（UCSF）糖尿病中心的 Bluestone 实验室。今天我将向您展示小鼠胰岛分离的操作流程。该实验包括向 C3H 品系供体小鼠的胰腺内注射胶原酶溶液，随后取出胰腺组织，进行消化处理，利用密度梯度离心法纯化胰岛，并通过手工挑选获得高纯度胰岛，最终将其移植至糖尿病 NOD 小鼠的肾包膜下，后者将作为受体动物。

在开始此操作之前，我们将ATE溶液用改良的Hanks缓冲液稀释，并根据我们所使用的C3H小鼠品系调整了其浓度。我们发现使用每毫升含0.8 mg胶原酶的溶液进行消化效果更佳，因此将采用该溶液注入胆总管以扩张胰腺。今天执行该操作的是糖尿病中心的Pavo Codre。他将进行注射操作，打开小鼠体腔，暴露肠道，然后向胆总管内注射溶液。

我们将用乙醇喷洒小鼠以压平毛发，然后通过脚趾夹捏来确认小鼠已正确处死。Pavo 现在将沿腹中线切开小鼠，暴露肠道和胰腺。同时将剪开膈肌，以确认小鼠已被处死。

在开始之前，我想指出一些重要的结构。胃位于此处，胰腺附着于其下方并延伸至十二指肠及上方区域。这是肝脏，我们将在此找到胆囊和胆总管，您可以在该位置清楚看到。

接下来，Pavo 将分离小肠，找到胆总管进入小肠的位置。暴露肠管后，我们使用蚊式钳在胆总管两侧进行夹闭。我们发现这种方法有利于更多的胶原酶进入胰腺，而其他研究团队则尝试将夹子直接夹在胆总管上方。

我们发现，这种方法更有利于酶进入胰腺。该操作较为轻柔，切勿撕裂肠道。

应让止血钳轻轻置于胆总管两侧。现在我们将找到胆囊，一旦胆囊暴露出来，便以其作为引导，将胶原酶注射至胆总管中。Powell 使用的是一支30号针头，连接含有3毫升胶原酶溶液的5毫升注射器。

当他进入胆总管时，会用胶原酶溶液扩张该导管，然后沿胆总管向下推进，直至接近肠道。在向下推进的过程中，酶溶液被持续泵入并注入胰腺。现在胰腺已充满胶原酶溶液，Powell 将移除止血钳，然后小心地将胰腺从肠壁上撕离，从该小鼠体内取出胰腺。

他将其从胃部取出。好的，然后以脾脏作为抓手，提起胰腺，再沿着胆总管缓慢剪下，就这样。胰腺被分离出来后，接着移除脾脏，然后他去除肠系膜组织，随后将胰腺放入含有两毫升胶原酶溶液的无菌玻璃小瓶中，并重新置于冰上。

我们将分离出的胰腺放入玻璃小瓶后，现需将其置于37度水浴中约17分钟。我们将胰腺置于50毫升锥形离心管架中，以防止其上浮。水浴开始时即启动计时器，消化过程随之开始。

消化时间结束后，取出离心管，轻轻振荡并轻柔吹打。一旦组织开始解离，立即将离心管置于冰上。在含有洗涤缓冲液的400 mL烧杯上方放置一个无菌滤网。

然后将胰腺消化液小心地倒入筛网上，使其流入洗涤缓冲液中。为了演示方便，此时已关闭通风橱，并将通风橱的玻璃门升起，以便观察操作过程。一旦胰腺消化液完全倒入烧杯后，需用相同的洗涤缓冲液冲洗样品管，并将洗涤缓冲液再次倒在筛网上。

我们有一个装有洗涤缓冲液的注射器。将用它用力冲洗滤网上的组织。目的是冲走所有未与基质结合的游离小孔结构，同时将膜结构和未消化的组织保留在滤网上。

当完成组织清洗后，通常会在操作结束时看到如下情况。将位于管底的胰腺组织转移至两个50 mL离心管中，对组织进行清洗，充分混匀后均匀分配，使每管中的组织沉淀体积相等。随后用更多清洗缓冲液冲洗烧杯。

冲洗管壁，以确保所有进入烧杯的组织都被回收。然后将样品等量分装到两个 50 mL 离心管中，每管 50 mL，再用洗涤缓冲液补至满管。

将组织反复倒置数次，然后放入离心机中。进行短暂离心。待离心机转速达到1000 RPM后，关闭离心机。

此时组织非常脆弱，眼状结构非常敏感，切勿过度挤压。移除试管后，此洗涤步骤还需重复三次。至此，第三次洗涤结束。

将50毫升锥形管中的组分转移至15毫升锥形管中，以1000 rpm离心后停止。吸除上清液，开始FI Call的第一部分。此时我们已进行到获得胰腺消化沉淀物的步骤。

我们将重悬该组织，使其充分分散，避免形成团块。加入第一层密度梯度液，即1108，每管加入5 mL。

然后将沉淀物充分混匀于各梯度溶液中。确保在最浓的梯度中获得良好的组织分布非常重要。接下来，我们将加入两毫升密度为1.096的溶液。

然后在上层加入两密耳厚度、密度为1 0 6 9的溶液，再在其上方加入密度为1 0 3 7的溶液。在叠加不同密度溶液时，注意不要混合各层。至此，所有液层均已添加至离心管中。

你可以看到这是 1 1 0 8 的顶部，9 1 0 9 6 的顶部，1 0 6 9 的顶部以及 1 0 3 7 的顶部。可以看出，即使尚未进行离心，组织已开始向其对应密度位置移动。将菲亚尔梯度液在 1800 RPM 条件下离心 15 分钟，当从离心机中取出离心管后，请记得保持刹车关闭状态。

在0 0 9 6层与0 0 7层之间，可以看到一层清晰的眼状组织带，即Pablo's。现在去除0 3 7层，以清除在处理过程中可能释放的组织碎片和DNA。使用无菌的塑料巴氏德吸管，他将移取胰岛层，并将其转移至含有25 mL洗涤缓冲液的50 mL锥形管中。

此步骤需快速完成，因为fol对眼点具有毒性。我们实际上已移除整个0 6 9和0 9 6层。Pavo剪去塑料移液管顶部，并用洗涤缓冲液冲洗。

然后将小孔板进行离心，离心条件与之前相同。将离心机升速至1000 RPM后停止，随后吸除上清液。小孔板将用洗涤液清洗三次。

我们刚刚完成了眼睑分离过程，从消化物开始，经过fol梯度分离，最终获得纯化的眼睑组织。在使用洗涤缓冲液进行第三次洗涤后，我们将眼睑组织重悬于RPMI培养基中，并将其接种到组织培养板中。这些眼睑组织现在已准备好用于体外实验或体内制备，例如眼睑移植。