一种简单高效的小鼠胰岛分离方案

本方案需要使用单一密度梯度，与更复杂的传统胰岛分离方法相比，显著降低了劳动强度并更具成本效益。该方案的主要优势在于酶可直接递送至胰腺，从而增强组织消化效果并提高胰岛产量。首先将小鼠四肢朝上固定于仰卧位，并用70%乙醇喷洒其身体。

使用盖玻片镊子和弯头手术剪，在腹部皮肤上做一个约三厘米长的横向切口，并拉开皮肤以暴露腹壁。在腹部腹膜上做一个三到四厘米长的纵向切口，充分暴露胰腺，并将小鼠置于解剖显微镜下。将肝叶向上推，以暴露呈淡粉色管状的胆管，并轻轻将右腰部和髂区的肠道移至腹腔右侧，以暴露胆管和肝动脉。

使用 Schwartz 微型止血钳小心夹闭胆总管，尽可能靠近肝脏位置，并辨认位于十二指肠乳头处的法特壶腹，该结构由胰管与胆总管汇合而成。用微型 Adson 镊子牵拉胆总管使其绷紧，将连接在含有 3 毫升新配制的胶原酶 P 溶液的 3 毫升注射器上的 30 号半英寸针头插入法特壶腹，将针头平行于管腔方向推入管内，深度约为管腔长度的四分之一。针头就位后，用微型 Adson 镊子固定针头，然后缓慢而稳定地将 3 毫升胶原酶 P 溶液注入胆管内。

如果胰腺的头部、颈部、体部和尾部区域均充分膨胀，则视为注射成功。正确进入壶腹并插管至胆总管，对于成功消化获取胰腺组织至关重要。穿破导管壁会降低细胞分离的效率。

使用弯头显微 Adson 镊子，从脾脏开始，沿胃部及十二指肠方向，小心地将膨胀的胰腺拉出。然后将胰腺放入一个含有 3 毫升冰冻胶原酶 P 溶液的 50 毫升消化管中。为获取胰岛，首先使用精细手术剪将胰腺剪切 3 至 5 秒，随后将消化管置于 37°C 水浴中，以每分钟 100 至 120 转的速度振荡 12 至 13 分钟。

孵育结束后，轻轻振荡试管约30秒，以破碎组织，直至溶液均匀，可通过观察细沙状的胰腺组织颗粒确认。组织一旦消化完成，立即将试管置于冰上，并加入40毫升冰冻终止液以终止酶反应。轻轻吹打重悬沉淀后，将消化后的组织在水平转子离心机中离心沉淀，随后每次用20毫升新鲜终止液洗涤，共离心两次。

最后一次洗涤后，将沉淀重悬于40毫升冰上预冷的HBSS中，再进行三次洗涤；最后一次洗涤后，将沉淀重悬于5毫升室温密度梯度溶液中。将离心管在低速下短暂涡旋，直至溶液均匀，然后向管中加入另外5毫升室温密度梯度溶液。接着使用10毫升移液器，以逐滴方式缓慢、轻柔地向管中加入10毫升室温HBSS，以形成密度梯度，并使用水平转子离心机通过密度梯度分离法分离细胞群体。

离心结束后，使用预先用冷的HBSS润洗过的10毫升移液管，从密度梯度与HBSS之间的胰岛层中收集5至10毫升。将胰岛转移至一个新的50毫升离心管中，该管内含有20毫升新鲜的冰上预冷HBSS，并在水平转子离心机中通过离心收集细胞。小心吸除上清液，仅保留最后3毫升，避免扰动沉淀物，随后每次用20毫升新鲜HBSS至少再清洗胰岛三次。

最后一次洗涤后，将上清液替换为4毫升37摄氏度的RPMI 1640培养基，并轻轻旋转离心管以悬浮沉淀。立即将胰岛倒入一个100毫米的培养皿中，并用5毫升新鲜RPMI 1640培养基冲洗离心管，将残留的胰岛收集到培养皿中，与其他胰岛合并。然后使用解剖显微镜和20微升移液器吸头，从培养皿中挑选表面光滑、呈健康球形或椭圆形的金棕色胰岛，转移至含有10毫升完全RPMI 1640培养基的新培养皿中。

收集完所有胰岛后，将胰岛置于无菌培养箱中，在37摄氏度、5%二氧化碳及湿润空气中孵育过夜。健康的优质胰岛呈光滑的圆形，而受损的不良胰岛则边缘粗糙。未消化的外分泌组织呈半透明状，且形态不规则。

通过观察胰腺脾部是否膨胀，可确认胶原酶P酶的正确灌注和分布。在低糖培养基中过夜孵育可使胰岛预先激活，以便于次日进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验，从而了解胰岛的胰岛素分泌能力。