小鼠胰岛分离方法：联合使用纯化胶原酶与中性蛋白酶

本实验的总体目标是从小鼠胰腺中成功分离出胰岛。首先从周围组织中分离出胰腺，然后插管胆管，以便用胶原酶蛋白酶混合液膨胀胰腺。

胰腺充胀后将其取出，并仔细分离胰岛。最后，将分离得到的胰岛进行过滤并接种，以供后续使用。最终，利用纯化的胶原酶和中性蛋白酶进行胰岛分离的方法，可获得最大的胰岛产量和最佳的胰岛形态。

与现有眼状体分离方法相比，该技术的主要优势在于我们使用了纯化的酶，消除了批次间的变异性。此外，我们对某些实验步骤进行了修改或改进，以改善眼状体的形态。动物安乐死后，在完全切开从肛门至横膈膜的腹腔之前，先用70%乙醇覆盖躯干。

接下来将小鼠置于解剖显微镜的载物台上。拉出盲肠和升结肠，并将其移至体腔外左侧，将肝脏叶推至膈肌处。若肝脏无法自行固定在该位置，可扩大体腔开口。

用弯钳夹住十二指肠，找到通向肝脏的肝动脉、门静脉和胆管束。用另一把弯钳将缝线插入动脉、静脉和胆管束下方，并尽可能靠近肝脏处扎紧。

使用两把弯镊，小心夹住十二指肠，找到附着于乳头处的胆管。在乳头位置，用一把镊子刺穿胰腺及胆管下方靠近乳头处的结缔组织。迅速将镊子穿过所形成的孔洞，并插入缝线，松松地用90度镊子在胆管周围打结，形成一个小环。

将小肠轻轻拉出，直至胆管绷紧。在持住肠管的同时，用超精细剪刀在乳头处作一横向切口，注意不要将胆管从乳头处移开。将一根导管插入胆管，然后轻轻收紧缝线，将其固定在导管周围。

接下来，用一个3毫升注射器吸取2.0毫升胶原酶-蛋白酶混合液。以缓慢且恒定的速度将该混合液注入导管中。当胰腺充分膨胀后，从胆管中移除导管。

从降结肠开始，剪断结缔组织，同时上提肠道，直至到达胆管。接着，将胰腺与脾脏及周围组织分离。最后，剪除缝线，取出胰腺。

取出后，将胰腺放入含有5毫升冰上预冷的HBSS的50毫升离心管中。待所有样品收集完毕后，将含有胰腺组织的50毫升离心管置于37摄氏度水浴中。轻轻振荡离心管15分钟，并检查组织解离情况。

确保仅握住管盖时组织易于分离。轻轻旋转12次以进一步解离组织。加入不超过30毫升的HBSS并离心。

小心吸除上清液，底部保留少量上清液，以免扰动细胞沉淀。使用连接14号针头的30毫升注射器，加入不超过10毫升的HBSS，并将悬液上下吹打两次。将细胞混合液通过塑料T型滤器过滤至50毫升离心管中。

用另外10毫升HBSS冲洗并离心。倾去上清液，将试管倒置在吸水纸上静置一分钟以沥干。每管中加入10毫升重新悬浮。

4°C 下 1100 × g 离心。加入 10 毫升 HBSS 重悬沉淀，并再次离心。使用大孔径 25 毫升移液管完全移除上清液 20 毫升，并将上清液通过倒置的 70 微米滤膜过滤。

将小孔直接过滤到培养皿中，并通过移液器将10毫升小孔培养基吹打过滤培养物进行冲洗。将小孔置于组织培养孵育箱中，直至准备进行实验。小孔的产量、形态和质量是评估小孔分离成功与否的一般参数。

此处显示了典型的内皮小孔形态。这些小孔呈圆形至椭圆形，大小相对均匀。对分离的内皮小孔进行了葡萄糖刺激的胰岛素分泌分析。

使用 Sigma Type 11 制备的眼状组织与使用 ci zyme TM, MABP 制备的相比，胰岛素刺激效果相似，表明眼状组织制备质量较高。观看本视频后，您应能充分理解如何对小鼠胆管进行插管。可使用 zyme 胶原酶和中性蛋白酶消化以分离眼睑组织，用于后续任何检测。