Saccharomyces cerevisiae 的微阵列分析

本实验的总体目标是通过检测经历氧化应激的酵母基因表达差异，向本科科学专业学生介绍微阵列技术。首先，从经过过氧化氢处理的酵母培养物及其未处理的对照样本中分离总RNA，以实现这一目标。实验的第二步是从这些RNA样品中生成并纯化cDNA。

然后利用cDNA通过体外转录制备生物素标记的cRNA。该实验流程的最后一步是将生物素标记的cRNA片段化，以便与AFI指标酵母基因芯片进行杂交。最终获得的结果可显示两种酵母样品间的基因表达差异，并通过生物信息学分析向本科生展示微阵列分析的强大功能。

佛蒙特州遗传学网络外展团队首次提出该方法的构想，是源于他们承担了一项任务，即向整个佛蒙特州的科学学生推广微阵列（microray）技术，以增强其科学教育。迄今为止，该方法已应用于该州八所学士学位授予院校的多个教学点。因此，使用微阵列教学模块的主要优势在于，它使我们能够向一组学习者讲授在实验室中日常广泛使用的通用分子生物学技术。

我们还可以利用这一平台向学生、教师以及各类团体开展教学。事实上，我们的项目中有学生与教授共同合作，他们学习一些需要精细操作的技术，例如RNA操作，这并非易事。

他们学习如何使用可视化试剂沉淀DNA。学生将实际操作他们在研究生阶段或日常分子生物学实验中会遇到的技术。尽管该方法适用于研究氧化应激和酵母，但它同样可应用于其他模式生物及您可能希望研究的其他生物系统。

基因表达的变化可能与发育变化、环境毒素、特定疾病状态以及其他众多因素相关。为了检测酵母在氧化应激条件下基因表达的差异，首先通过酶解法从两个酵母培养物中提取总RNA。其中一个培养物经0.5毫摩尔过氧化氢在Hank's平衡盐溶液中处理一小时以诱导氧化应激，另一个培养物则仅用HBSS处理作为对照。

首先，用适当的标识信息标记两支1.7毫升的微量离心管。将1.5毫升相应的酵母培养物转移至每支离心管中。在室温下以5,000 ×g离心2分钟。

离心后，使用微量移液器小心移除上清液并弃去，注意不要扰动沉淀。在继续操作前，检查沉淀是否足够大。如果沉淀过小，向含有沉淀的同一离心管中加入1.5毫升培养物，再次离心以获得更大的沉淀。

用微量移液器弃去上清液，尽可能去除酵母沉淀中的液体。然后向酵母沉淀中加入100 µL SG缓冲液和30 µL溶壁酶溶液，涡旋混匀。将两个试管在室温下孵育30分钟，孵育期间保持静置。

每10分钟轻轻摇动每个试管以生成球形体。进行酵母球形化培养时最关键的步骤之一是确保处理后真正形成了100%的球形体。这意味着并非所有的溶壁酶效果都相同。

因此，您必须进行检查，以确保所用的裂解酶能够获得良好的球形化效果。这意味着您需要取少量样品，将其置于显微镜载玻片上，并加入0.1% SDS，在显微镜下观察，以确认原生质体是否成功形成。为观察完整的球形化过程，可吸取10微升酵母样品置于载玻片上，在显微镜下边观察边加入1微升0.1% SDS，使酵母细胞膨胀并形成完美的球体或类球体。需要注意的是，出芽细胞也应形成S形球体。

若观察到部分球形铺板，建议延长裂解酶处理时间。当每管中加入 350 微升 BRLT 缓冲液后确认已实现完全的球形铺板时，再加入 250 微升 100% 乙醇。确保管盖紧密闭合，用手按住管盖后剧烈涡旋震荡一分钟。

该实验步骤将裂解Sphero平板中的细胞。随后，使用R和easy Z自旋柱从两种培养物中收集并纯化RNA。最后，通过1.2%预制琼脂糖凝胶电泳评估提取RNA的质量，以制备生物素标记的cRNA。

首先利用从酵母细胞中提取的总RNA通过逆转录合成cDNA。在cDNA生成后，准备用于cDNA沉淀的相锁凝胶管，将相锁凝胶管以最大速度离心一分钟，确保凝胶位于管底。请勿涡旋振荡相锁管以沉淀cDNA，用移液器吸取162微升pH为8.0的Tris缓冲酚-氯仿-异戊醇（PCI）混合物的下层液体，加入至第二条链cDNA合成反应管的162微升反应产物中，此步骤需使用等体积的水相与有机相混合物。

涡旋5秒以混匀内容物。接着，使用微量移液器将全部CD N-A-P-C-I混合物转移至相锁凝胶管中。请勿涡旋相锁凝胶管，以最高速离心2分钟。

然后使用微量移液器将相锁凝胶管中的上层液体转移至新标记的1.7毫升离心管中。尽量收集尽可能多的该层液体。向该1.7毫升微量离心管中加入405 µL 100%乙醇、80 µL乙酸铵以及1 µL沉淀染料涡旋液。

将离心管轻轻放入离心机中，管盖铰链朝外，以最大转速离心20分钟。室温下离心结束后，小心从离心机中取出离心管，注意不要扰动CD NA沉淀。由于沉淀染料的存在，沉淀应呈粉红色，大小约如一粒盐。

在管子铰链下方的一侧，将CD NA沉淀置于冰上，并立即开始清洗沉淀。开始清洗CD NA沉淀的操作时，使用P 1000微量移液器小心地将管中所有上清液移除，注意不要扰动沉淀。

将500 µL冰冷的80%乙醇加入管中。轻轻盖紧管盖，缓慢倒置数次。密切观察沉淀物，确保其未从管壁脱落。

如果沉淀物脱落，可通过将离心管放回离心架并静置，使沉淀物重新沉降至管底，或以最高速度离心15秒，使沉淀物重新聚集。接下来，使用P1000微量移液器小心吸除乙醇，避免扰动沉淀物。倾斜离心管，以便尽可能多地移除液体。

加入适量冰冷的80%乙醇，盖紧管盖后缓慢倒置数次。用P1000微量移液器尽可能吸除全部乙醇后，将离心管以最大转速离心5秒。

然后使用 P 10 微量移液器小心吸除残留的少量乙醇，避免扰动沉淀。将管盖打开，置于干燥箱中 10 至 20 分钟，以挥发残留的乙醇。沉淀干燥后极易丢失，因此请轻柔操作离心管，并及时盖上管盖。

干燥完成后，观察干燥沉淀物以确认其存在于离心管中。最后，将干燥沉淀物重悬于 22 µL 无 RNA 酶的水中，并将离心管置于冰上。随后，此 cDNA 将用于通过体外转录（使用 Enzo BioArray 试剂盒）制备生物素标记的 cRNA。

在生物素标记的cRNA经过纯化和定量后，需进行片段化以制备靶标。一旦cDNA合成完成，我们便采用标准的体外转录方法来生成生物素标记的cRNA。cRNA在应用于微阵列芯片之前必须经过片段化处理。

开始此操作时，将相当于五微克的 CRNA 转移至一个已标记的 0.5 毫升 PCR 管中。加入无 RNA 酶的水，使总体积达到 16 微升，然后向管中加入 4 微升 5 倍浓度的片段化缓冲液。管中的总体积应为 20 微升。

涡旋混匀试管并离心10秒。然后在94摄氏度下孵育试管30分钟。在热循环仪中，孵育结束后将试管置于冰上。

通过使用1.2%预铸AROS凝胶进行电泳，分析各样本中已断裂和未断裂的CRNA。电泳完成后，在透射成像仪上观察凝胶并获取图像。将最终的合成产物杂交至拟酵母基因芯片，并在此展示微阵列分析的代表性结果。

此图是 atrics 基因芯片操作软件生成的扫描型 atrics 酵母基因芯片图像示例。该图为二维散点图，展示了约 6,700 个基因的全部遗传转录本，用于比较对照组与处理组酵母的数据。每个点代表一个单独的基因。

用紫色标记的基因为差异表达基因，而用红色标记的基因则无差异表达。在此示例中，大多数差异表达基因均为参与细胞周期调控的基因，其功能描述已标明这一点。该流程图来自注释可视化与综合发现数据库，展示了在受影响的生物学通路中的差异表达基因。

用红色星号标注的基因为减数分裂通路中表达下调的基因。最后，此处展示了使用 Geo Species Gene Sifter 软件生成的火山图的代表性结果。对照样本与处理样本之间的比较采用 P 值截断值为 0.05，表达变化倍数截断值为 1.5 倍。

我们选择使用酵母，是因为酵母易于快速培养，但我们同时也意识到，操作酵母最关键的部分实际上是制备质量良好的原生质球（sphero plating）。在微阵列实验中，我们不希望发生不完全消化，导致仅获得处于G1期或G2/M期的原生质球细胞。否则，我们进行微阵列实验所用的酵母将仅处于特定的复制阶段。

本实验中我们试图强调的另一个复杂问题是，沉淀 DNA 是人们日常谈论的操作，但实际操作并不一定容易。在我们的实验模块中，我们使用了专用的离心管和可视化试剂，从而能够成功离心沉淀 DNA，并直接观察到沉淀物，这为学生和教师都带来了便利。

因此，该模块在开发完成后可应用于DNA和RNA研究的各个阶段。该模块实际上为本科院校的教师探索其他模式生物或其他处理方案铺平了道路，这些方案可能与现有课程体系相容，或符合他们自身的研究兴趣。例如，有研究团队考察了除草剂处理对酵母的影响，另一个团队研究了LAMP IDE处理在酵母中的作用，而还有一个团队则研究了他们特别感兴趣的一种哺乳动物细胞系中的发育变化。

最后，还有另一项研究考察了不同光源对拟南芥或其他植物的影响。在观看本视频后，您应能充分理解如何与本科科学专业学生一起开展微阵列实验，包括从酵母中分离总RNA、合成cDNA，以及对生物素标记的cRNA进行片段化。通过亲自动手实践此类高水平技术，有助于巩固和加强本科阶段的科学教育。