Saccharomyces 酵母物种间热耐受性差异的全基因组范围相互半合子分析遗传定位

我们的方法是首批能够在物种间而非物种内以全基因组规模解析性状差异遗传基础的方法之一。该技术的主要优势在于高通量、高分辨率以及广泛的适用性。开始此操作时，从-80摄氏度的保存条件中取出JR507冷冻保存菌株，并将其划线接种至YPD琼脂平板上，以获得单菌落。

在26摄氏度下培养两天，或直至菌落出现。随后，取JR507单菌落接种于250毫升玻璃锥形瓶中的100毫升液体YPD培养基中，在28摄氏度、200 RPM振荡条件下培养24小时，或直至进入稳定期。次日，测定过夜培养物的od600。

取部分过夜培养物，用新鲜的液体YPD培养基将其回稀释，转入一个新的1升锥形瓶中，制备成OD600为0.2、体积为500毫升的新培养物。重复此操作三次，共制备四份OD600为0.2的培养物，所有新培养物均使用同一批过夜培养物。将所有培养物置于28°C、200 RPM振荡条件下培养6小时。

此后，将两份500毫升的培养物混合，制成一份1升的培养物；再将剩余的两份500毫升培养物混合，制成第二份1升的培养物。首先，将每份1升的培养物分别分装到20个塑料锥形管中，每管50毫升，共得到40管。

留出20个试管。将剩余的20个试管在1000 × g条件下离心3分钟，使酵母细胞沉淀。弃去上清液，每管沉淀用25毫升无菌水通过涡旋振荡重新悬浮。

在1000 × g条件下离心3分钟。弃去上清液，每份沉淀物中加入5 mL 1× Tris-EDTA 0.1 M醋酸锂缓冲液，通过涡旋振荡重悬。在1000 × g条件下离心3分钟。

弃去上清液，再用五毫升 1X Tris-EDTA 含 0.1 M 乙酸锂缓冲液重悬每份沉淀，通过涡旋振荡混匀。在 1000 × g 条件下离心 3 分钟。细胞离心的同时，准备至少 120 毫升含有聚乙二醇、乙酸锂和 Tris-EDTA 缓冲液的溶液。

将该溶液置于冰上保存。为制备用于转化的质粒 DNA，首先将 4 mL 鲑鱼精子 DNA 在 100 摄氏度下煮沸 5 分钟，随后立即在冰上冷却 5 分钟。

将20毫升浓度为538纳克/毫升的pJR487与4毫升低温鲑鱼精子DNA混合。使用前将该混合物置于冰上保存。接着，将600微升血浆与精子DNA混合物加至每个细胞沉淀上方。

向每份沉淀中加入三毫升 PEG 乙酸锂 TE 混合液。通过反复吹打混匀，然后涡旋振荡。将离心管在室温下孵育 10 分钟。

然后将每支试管在39摄氏度水浴中热激26分钟，期间每隔几分钟颠倒混匀一次。以1000 × g 离心3分钟。弃去上清液，每管沉淀物用10 mL YPD通过涡旋振荡重新悬浮。

此后，将全部20个管中的内容物合并至一个新的玻璃烧瓶中。向另一个一升的玻璃烧瓶中加入433.4毫升液体YPD培养基，然后将66.6毫升的细胞转移至该烧瓶中。

重复此转移过程两次，以用尽全部转化后的细胞体积。然后测定每个新制备的500毫升培养液的od600。将三个培养液均在28°C、200 RPM振荡条件下培养2小时。

随后，向每个锥形瓶中加入0.5毫升浓度为300毫克/微升的G418，使终浓度达到300微克/毫升。将锥形瓶放回28°C、200转/分钟的摇床培养箱中。对剩余的20个离心管重复上述整个过程。

此时应有六个1升的锥形瓶，每个瓶中均含有500毫升已添加G418的细胞。将这六个锥形瓶在28°C条件下以200 RPM的转速振荡培养约两天，或直至每个瓶中的OD600达到约2.3。随后，将这六个瓶中的培养物合并为一个单一的培养体系。

用此混合培养物接种两个新的1升锥形瓶，每个锥形瓶中含有500毫升YPD培养基和G418，使od600达到0.2。将这两个新培养物在28°C、200 RPM振荡条件下过夜培养，直至od600达到约2.2。之后，将两个培养物合并为一个培养物，并测定合并后培养物的od600。

将25毫升该培养物在1000 × g条件下离心3分钟。根据文本方案中所述方法，计算25毫升培养物中细胞的总od600单位数。弃去上清液，并将细胞重悬于适量水中，制备成od600为每毫升1.85的细胞悬液。

使用玻璃珠，将1毫升重悬的细胞分别涂布于12块含有5-FOA的大型方形完全合成琼脂平板上。将每块平板在28°C下培养1至2天，或直至平板上形成菌苔。随后，使用小型无菌刮刀将每块平板一半面积上的细胞刮下，并收集至含有35毫升无菌水的离心管中。

对剩余的六个培养皿重复此过程，最终得到两管悬浮于水中的细胞。将细胞悬液合并至一个烧瓶中，并以水作为空白对照，测定悬液的od600。使用水调整细胞浓度，直至od600达到每毫升44.4。

接下来，按照文本方案中的说明制备细胞冻存液，并于负80摄氏度保存。在本研究中，酿酒酵母（S.Cerevisiae）与奇异酵母（S.Paradoxus）杂交形成不育杂合子，随后对其进行转座子诱变。每个诱变后的克隆均为半合子，即二倍体杂合子中某个基因的一个等位基因被破坏。

将半合子菌株在高温条件下进行竞争培养，并从每种培养物中提取DNA。将DNA片段化后连接接头，利用转座子特异性引物和接头特异性引物扩增转座子与基因组之间的连接区域。通过统计扩增产物的群体测序读段数量，报告该克隆在群体中的适应性。

根据此次测序获得的结果，可以比较两类半合子在两种温度下特定基因的半合子丰度：一类克隆仅依赖酿酒酵母（S. cerevisiae）等位基因为野生型且具有功能，另一类克隆则仅依赖奇异酵母（S. paradoxus）等位基因。在此代表性实验中，在八个看家基因上检测到了强烈的信号。

在每种情况下，杂交菌株中酿酒酵母等位基因的转座子插入均导致其在高温下生长受损。这些低适应性插入位点代表了可能决定酿酒酵母与悖论酵母之间热耐受性差异的候选因子。现在我们已完成该实验，便可进一步解析这两个物种之间其他不同的性状，例如冷耐受性或盐耐受性。