mRNA分子的荧光可视化与分析 原位 杂交在 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

以下实验的总体目标是在单个酵母细胞中以单分子特异性检测 mRNA 分子的存在。首先，使用含有裂解酶的缓冲液固定酵母细胞和甲醛。对细胞进行透化处理，直至大多数细胞不再呈现明亮的相位对比图像。

接下来，将通透化的细胞与荧光标记的单链DNA分子孵育，然后将细胞置于经等离子体清洁的盖玻片上。最终，通过荧光显微镜获得的结果可以详细揭示单个细胞中mRNA分子的存在及其定位。该技术相较于现有方法（如基因表达分析、微阵列和Northern印迹）的主要优势在于，能够在单个细胞中直接观察单个mRNA分子。

该方法有助于回答转录领域中的关键问题，包括量化细胞群体中每个细胞内的臂RNA数量，从而为启动子水平的调控模型提供依据。此外，该方法还可用于确定转录本在细胞周期中的定位及其半衰期。

在等离子体预处理真空室中，将盖玻片放置在载玻片上。然后将真空室放入微波炉中，并确保其密封。启动泵后，打开泵的开关。

现在打开真空泵，然后启动微波，待等离子体可见后五秒停止。随后关闭真空泵，再关闭抽气泵。拉出真空腔室。

然后将清洁面朝上的盖玻片转移至12孔板中，在最低培养基中培养酵母，使其A600达到约0.1至0.2。10 mL细胞可提供约10次杂交所需的量。

向培养基中直接加入十分之一体积的37%甲醛，在室温下孵育45分钟。以3000 ×g离心5分钟。将沉淀重悬于1毫升缓冲液B中，并转移至微量离心管中。

在微量离心管中用一毫升冰冻缓冲液B洗涤两次，13,000 RPM离心一分钟。接着，加入一毫升sphero包被缓冲液，37摄氏度孵育15分钟。

每隔几分钟在显微镜下观察细胞，直至大多数细胞变为黑色。然后用预冷缓冲液洗涤两次。B. 以低速 3,500 RPM 离心。

加入1毫升70%乙醇重悬。轻轻悬浮沉淀，并在4摄氏度下放置过夜，或在-20摄氏度下长期保存。为制备杂交溶液，将1至3微升探针加入100微升杂交缓冲液中。

然后涡旋并离心。我们已使用三组不同的探针同时成像了三个不同的基因。现在离心固定的酵母样品，并吸去洗涤缓冲液。

加入杂交溶液，于37摄氏度下避光、轻轻振荡孵育过夜，次日进行后续操作。将洁净的盖玻片用150微升0.01%多聚赖氨酸处理5分钟，然后吸除液体并空气干燥。

将载玻片用双蒸水洗涤三次，其中一次使用1×SSC重悬，随后风干。将细胞悬浮于150微升浓度为0.1微克/毫升的溶液中。新鲜配制DAPI染色液，取部分细胞悬液滴加至经多聚赖氨酸处理的盖玻片上，孵育30分钟。接着，将ProLong Gold封片剂解冻至室温。

取三微升样品置于载玻片上。然后向盖玻片加入约0.5毫升乙醇。在12孔板中，用镊子夹住盖玻片并将其取出，室温下晾干。

将盖玻片细胞面朝下置于封片剂上，在避光条件下静置数小时或过夜，使其充分固化。用指甲油密封边缘，随后进行成像。在参考点周围采集一系列图像，总距离为5 µm，步长为0.2 µm。

对每种染料通道分别进行成像，每个通道对应一组探针。然后按照随文所述步骤进行操作。通过流域分割法识别细胞时，先使用径向梯度识别信号点，并通过高斯拟合对信号点进行测量。

通常，通过鱼类图像计算直方图，用于确定单个细胞中mRNA的数量。基于显微镜的RNA定量一个重要优势在于可以获得转录本定位信息。例如，该鱼类使用单个探针在具有可诱导CCB CBF单等位基因的单个细胞中识别mRNA。

由于许多 mRNA 分子存在于转录位点，因此很容易识别细胞核内转录位点的存在及其位置。利用不同的染料标记不同基因的 mRNA，可在同一细胞中实现多种 mRNA 分子的定量分析。在本实验中，酵母细胞在α因子和山梨醇存在下进行孵育。使用 Stelara 探针进行 FISH 检测，结果显示一个细胞仅对信息素产生响应，表现为一个红色的 FUS1 起始位点。

与此同时，另一个细胞主要对山梨醇产生响应，其中 S TL 一个起始位点被标记为绿色。观看本视频后，您应能够充分理解如何在酵母中对单个 mRNA 分子进行标记与可视化。一旦掌握，该技术可在两天内正确完成。

请确保细胞浓度足够高。样本稀释会导致需要成像和存储的视野增多。