改良的小鼠胚胎干细胞检测法用于量化心脏诱导效率

以下实验的总体目标是确定小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中所需的关键时间调控机制。首先，在96孔圆底板中形成类胚体，以标准化类胚体的生成，作为第二步，将蛋白质或化学调节剂在预设的时间范围内添加到类胚体中，从而实现对所研究通路的时间控制。

接下来，通过手动计数跳动的拟胚体（EBS）以确定不同信号调控方案的诱导效率。根据形成的跳动拟胚体所占百分比，并结合悬滴法验证，获得结果以揭示心肌细胞分化过程中关键信号通路的时间需求。该技术相较于现有的悬滴法等方法的主要优势在于，其标准化并简化了原本劳动密集的操作流程，且能够提供简单直接的定量读数。

该方法有助于解答干细胞生物学领域中的关键问题，例如鉴定指导干细胞向目标细胞类型分化的关键信号通路。开始此操作时，将 Gro 小鼠胚胎干细胞在添加了白血病抑制因子的培养基中，于 10 厘米细胞培养皿中进行培养。当胚胎干细胞融合度达到 50% 至 70% 时，即可用于后续实验。

移除 ES 培养基，并用 5 毫升无菌 PBS 洗涤细胞一次。每孔加入 2 毫升 0.05% 胰蛋白酶 EDTA，于 37°C 孵育 3 至 5 分钟。随后，每孔加入 3 毫升 ES 培养基以终止胰蛋白酶 EDTA 的作用，并将细胞转移至 50 毫升离心管中。

以每分钟1000转的速度离心3分钟。离心后，弃去上清液，并用所需体积的EB培养基重悬细胞沉淀。计数细胞数量，然后将细胞稀释至每毫升5 × 10³个细胞。

使用多通道移液器，在EB培养基中向96孔圆底微孔板的每孔加入含有细胞的100微升EB培养基。所需96孔板的数量取决于实验的条件数和时间点数。将96孔圆底微孔板置于加湿的37°C、5% CO₂培养箱中，以确定心脏发生关键信号通路的关键时间窗口。

向 ES 细胞中加入特定信号通路的调节剂。在 96 孔圆底培养板中，将用培养基稀释的信号调节剂在不同时间点分别加入各孔中。每块 96 孔板中一半的孔用于每个处理起始时间点。

在每个时间点的其余48个孔中加入溶剂对照。在不同的终止时间点，我们将通过更换培养基来洗去各孔中的信号调节剂，在此操作过程中必须格外小心，以避免破坏胚胎体。在不同的终止时间点，通过更换胚胎体培养基来洗去调节剂。将96孔板倾斜约10度角，然后使用多通道移液器轻柔地移除孔中的培养基。

对于超过 48 小时的处理，向每个孔中重新加入不含调节剂的 EB 培养基。每隔两天更换一次添加了新鲜调节剂的 EB 培养基，直至达到预期的终止时间。将胚胎干细胞转移至 96 孔板以诱导 EB 形成后第 7 天，通过显微镜观察 EB 的收缩情况。

将出现收缩的拟胚体（EBS）所在的孔标记为阳性孔，以计算不同处理时间下收缩的拟胚体百分比。通过96孔板实验确定的心脏发生信号时间窗口，可在由悬滴法形成的悬滴拟胚体（EBS）中进行验证。首先，在培养皿中加入三到四毫升磷酸盐缓冲液（PBS），以防止后续悬滴发生变形。

接下来，将制备好的胚胎干细胞悬液以每毫升2.5×10⁴个细胞的终浓度倒入细菌培养皿中以便操作。使用多通道移液器将20 µL胚胎干细胞悬液滴加到培养皿倒置的盖子上。注意各液滴之间不得相互接触。

通常，一个皿盖最多可容纳80滴。然后将皿盖翻转，盖在含有PBS的培养皿上，在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育48小时，以促进拟胚体（EB）的形成。48小时后，用3毫升EB培养基将每个皿盖上由悬滴形成的拟胚体冲洗下来。

将两个EBS盖子放入新的培养皿中。在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中培养4天。在第4天时，将悬浮状态的EBS转移至经0.2%明胶包被的6孔板中。每孔转移约30个EBS，并在悬挂液滴形成后第7天，根据96孔板实验确定的时间点加入信号调节剂进行培养。

在显微镜下观察拟胚体（EBS）。在96孔板的圆底孔中培养的胚胎干细胞（ES细胞）将形成拟胚体，如本图所示为第4天形成的代表性拟胚体图像。胚胎干细胞向心肌细胞分化的关键时间点，是指在加入信号通路调节剂后，与对照组（溶剂处理组）相比，出现收缩性拟胚体比例最高的时间段。图中显示的是在96孔微量培养板上，经背部吗啡处理的胚胎干细胞在分化第10天时自发形成的心肌细胞收缩灶。

观看本视频后，您应能够充分理解如何高效地识别胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中关键信号通路的重要时间调控节点和作用时间窗口。