同步电刺激与机械刺激以增强细胞的心肌生成潜能

这是一种对细胞施加电机械刺激的方法。该方法具有多种应用，可用于研究刺激对细胞群体的影响、体内递送前的预训练以及细胞成熟。其优势在于，可以使用同一设备单独或同时施加电刺激和机械刺激，同时保持无菌环境且不破坏病毒的完整性。

该技术是实现我们治疗目标的一种间接方法。经过电机械刺激的细胞被认为是一种有潜力用于治疗心肌内层的细胞群体。该方法通常属于心血管领域，但也可能应用于神经系统。

这是一种简单的技术，但需要耐心。最困难的部分是处理微小的部件，并始终保持无菌状态。操作中有一些细微之处难以用语言解释清楚，因此视觉演示非常有帮助。

首先将12个已清洗的PDMS结构转移至无菌的10厘米培养皿中。为确保完全灭菌，将培养皿暴露于紫外光下照射5分钟。随后将每个结构分别转移至独立的35毫米细胞培养皿中，或立即用于细胞接种时可转移至6孔板中。

开始细胞接种时，首先用5 mL的1×PBS洗涤一个融合的T75培养瓶中的心源性ATDPCs。为使细胞脱离，加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，并在37°C下孵育5分钟。

然后加入 5 mL 完全培养基以灭活胰蛋白酶-EDTA。将所有脱落的细胞收集至 15 mL 离心管中。用 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞培养瓶两次，以收集残留的细胞，并将洗涤液一并加入 15 mL 离心管中。

在22°C下以230 ×g离心五分钟。弃去上清液，将细胞重悬于2毫升完全培养基中，并用血细胞计数板进行计数。将200 µL心脏来源的ATDPCs接种至各含有PDMS结构的培养板中，使次日细胞覆盖约80%的接种表面。

在37摄氏度、5% CO2条件下孵育。每孔加入2毫升预热的完全培养基，轻轻混匀。将细胞与构建物在37摄氏度、5% CO2条件下孵育过夜。

开始此操作之前，从12个构建体中指定6个用于电机械刺激，其余6个作为无刺激对照组。使用70%乙醇清洁刺激装置。将刺激装置、无菌电极和镊子放入超净工作台内。

为了便于操作电极和构建物，从每块细胞培养板中移除90%的培养基。将PDMS构建物放置在靠近磁铁的正确位置，以确保固定磁铁与可移动磁铁之间产生磁吸引力。在保持整个过程无菌的条件下操作接种了细胞的PDMS构建物和电极，是上述两个最关键的步骤。

然后，将铂丝连接到电极连接器上。将电极的聚四氟乙烯（PTFE）部分放置在PDMS结构中指定的位置。向每个结构中加入2.5毫升新鲜的、预热的完全培养基。

将所有PDMS构建体放置到位并电连接至平台后，将平台放回37摄氏度、5% CO2培养箱中，然后连接电源和机械源。通过电刺激器的用户界面以及控制机械刺激的应用程序界面设置刺激程序，指定电刺激和机械刺激的参数条件。

为设置同步，请打开电刺激器，等待主菜单显示在屏幕上。然后选择选项二“编辑序列”，并按 Enter 键。在编辑序列菜单中，使用模式选项卡，通过点击“加号”选择“电流”，然后按 Enter 键；对于周期，使用加/减号选择“1000”，然后按 Enter 键；对于触发模式选项卡，选择“软件外部触发”，然后按 Enter 键；对于幅度选项卡，使用加/减号选择“1”，然后按 Enter 键。返回主菜单后，选择选项 4，然后选择“生成序列”，并按 Enter 键。在控制应用程序面板的机械刺激部分，首先在“正周期”文本控件中输入“1000”。

然后在“ON时间”文本控件中输入500，以设置机械脉冲持续时间。最后在位移文本控件中输入2000，以实现10%的构建物伸长。每周更换两次细胞培养基，先移除旧培养基，然后在PDMS支架两侧加入温热的新鲜培养基。

在第七天实验结束时，按照文稿中所述方法收集样品。经电机械刺激的心脏来源ATDPCs增强了其心肌生成潜能。实时PCR结果显示，早期和晚期心脏基因的表达均有所上调，特别是心脏转录因子GATA-4、结构标志物β-肌球蛋白重链以及与钙相关的基因Connexin43。

针对肌动蛋白纤维的鬼笔环肽染色显示，大多数细胞沿垂直图案排列。连接蛋白43主要分布在细胞质和质膜上，通过缝隙连接参与细胞间通讯。MEF2和GATA-4转录因子位于心源性ATDPCs的细胞核内。

但在皮下ATDPCs中未检测到GATA-4。细胞质标志物SERCA2和肌节α-肌动蛋白未显示出心肌细胞典型的成熟肌节结构，且在对照组和刺激组细胞群体中均未观察到搏动现象。

在本方案开始时，健康的细胞单层以及整个操作过程中保持无菌状态至关重要。在样品采集后，可进行标准的基因组蛋白表达技术操作。该技术有助于更好地理解细胞电刺激和/或机械刺激的作用。

直到最近，还无法使用同一设备进行刺激，这使得结果更难比较。