高通量心脏毒性筛选：利用成熟的人诱导多能干细胞来源心肌细胞单层

本方案具有重要意义，因为它能够将商业来源或实验室自制的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）诱导成熟为类似成人心肌细胞的表型，从而显著提高hiPSC-CMs在心脏毒性筛选中的预测价值。该方案的主要优势在于，能够以高通量形式获得成熟的hiPSC-CMs，用于钙离子或电压变化的光学标测。本方案可用于研究疾病机制，或用于药物心脏毒性筛选。

本实验操作将由我实验室的研究助理 Jeffrey Creech 演示。在心肌细胞接种前 1 小时，用 200 微升汉克斯平衡盐溶液（Hank's balanced salt solution, HBSS）将成熟诱导型细胞外基质（maturation-inducing extracellular matrix, MECM）培养板洗涤两次。保持孔内湿润。

将心肌细胞管从液氮罐转移至干冰中，并通过稍微打开管盖释放压力。接着，重新密封管盖，并在水浴中解冻4分钟。细胞解冻后，在打开管子前用70%乙醇喷洒管体。

用1毫升移液器将细胞转移至15毫升锥形管中。向冻存管中加入1毫升铺板培养基，并将洗涤液转移至15毫升锥形管中。然后，缓慢滴加1毫升铺板培养基，并轻轻振荡管子。

重复此步骤，直至转移8毫升铺板培养基。将15毫升离心管在300 × g条件下离心5分钟，并将沉淀重悬于1毫升铺板培养基中。取一份等分试样，使用血细胞计数板进行活细胞计数，然后加入铺板培养基，使细胞浓度达到每毫升7.5 × 10⁵个细胞。

使用多通道移液器将细胞悬液每孔100微升加入MECM包被的96孔板中，细胞培养2天。随后，更换为200微升维持培养基，继续培养7天，并在第5天更换一次培养基。第7天时，按照文中所述方法进行EP检测。

若选择延长细胞培养，务必每隔一天更换一次培养基。为通过磁性激活细胞分选（MACS）纯化人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CM），请吸除细胞培养基，并用1毫升HBSS洗涤细胞。随后加入1毫升0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），孵育10分钟以解离细胞。接着，加入2毫升铺板培养基重悬并单细胞化细胞，以终止胰蛋白酶/EDTA的消化作用。

从六个孔中使用70微米细胞筛将细胞收集到一个50毫升的锥形管中。用3毫升铺板培养基冲洗细胞筛后，对细胞进行计数。计数后，将细胞沉淀用2毫升冰MACS分离缓冲液离心洗涤，然后将每5 × 10⁶个细胞重悬于80微升冷MACS分离缓冲液中。

加入20 µL冷的非心肌细胞去除试剂盒溶液，混匀后置于冰上孵育10分钟。用4 mL冷的MACS分离缓冲液在300 × g离心5分钟洗涤细胞后，将细胞沉淀重悬于80 µL冷的MACS分离缓冲液中。每5 × 10⁶个细胞加入20 µL冷的抗生物素微珠，轻轻混匀细胞悬液，然后置于冰上孵育10分钟。

在样本孵育的同时，将装有30微米预分离过滤器的阳性去除柱置于MACS分离器上，并在柱下方放置已标记的15毫升收集管。接着，用3毫升冷的MACS分离缓冲液预润每个柱子。将经抗体处理的细胞悬液与2毫升MACS分离缓冲液混合，然后加入柱中。

向每根柱中加入 2 毫升 MACS 分离缓冲液，收集 12 毫升流穿的心肌细胞悬液。离心心肌细胞并弃去上清液，然后将心肌细胞重悬于 1 毫升铺板培养基中。为确定浓度，对细胞进行计数，并调整体积至所需接种密度，随后将纯化的心肌细胞接种至 MECM 96 孔板上。

吸弃96孔板中每孔的心肌细胞维持培养基，更换为100 µL电压敏感性染料（VSD）或钙离子敏感性荧光探针（CSF）。孵育30分钟后，将染料更换为检测培养基或HBSS。在使用高通量光学标测设备采集基线数据前，将细胞在37 °C条件下平衡。

为了进行急性暴露测试或绘制长期暴露于目标药物的细胞图谱，需将药物用二甲基亚砜（DMSO）稀释，并在使用前以20摄氏度保存为储备液，随后将其在HBSS中稀释至所需浓度。在96孔板中进行心脏毒性测试时，每种化合物设置四个剂量，每个剂量至少包含八个孔。所用剂量范围应涵盖低于和高于临床有效治疗血浆浓度的水平，并包括有效剂量。

与给药前的基础电生理学测量类似，在慢性研究中，每次药物处理后至少30分钟再进行电生理记录。在完成基础记录后，对表达GCaMP6m的成熟hiPSC-CM单层细胞至少施加四种剂量的每种药物，每种剂量至少八个孔。药物与细胞平衡30分钟，并在数据采集前及采集过程中将细胞升温至37摄氏度。

在完成整块培养板的基线记录后，向每个孔中加入500纳摩尔的异丙肾上腺素，以获得显著的药物反应数据，并量化异丙肾上腺素对单层细胞搏动频率、收缩幅度和钙瞬变持续时间的影响。为获取光学标测数据，打开前面板抽屉，将培养板放置在板式加热器上。启动采集软件后，在软件中设定文件保存位置，选择10至30秒的采集时长以及较高的帧率以实现更高的时间分辨率，然后点击“开始采集”。

打开分析软件，在“导入筛选”选项卡中，选择“浏览单个文件”或“拼接多个文件”以重建微孔板。选择文件后，输入行数和列数，并选择“自动”。接着，选择“更新像素大小”，输入每个像素对应的实际距离，并使用“孔位向导”确定图像中各孔的位置，然后点击“处理保存”，进入下一个选项卡。

打开 ROI（感兴趣区域）选项卡，选择手动绘制 ROI、自动绘制 ROI，或完全不使用 ROI（此时将对整块板进行分析）。在孔中选定区域后，单击“处理并保存”按钮进入下一步。勾选“隐藏孔”和“仅显示已筛选”复选框以查看 ROI。

打开分析选项卡，选择每个孔或感兴趣区域（ROI），以确认自动搏动检测的准确性。通过选择单个搏动并按键盘上的删除键，可从轨迹中添加或删除搏动。完成后，点击保存。

接下来，点击“分析”选项卡中的“时空图”按钮，并添加一条直线以生成时空图，用于可视化每个孔或感兴趣区域（ROI）的数据。选择水平或垂直线后，点击“生成图表”。在确认搏动检测准确无误后，进入“导出”选项卡，选择文件格式，进入“搏动统计”选项，然后点击“导出”。

导出后，打开数据文件并运行选定的统计分析程序。相差显微成像显示，接种在MECM上的hiPSC-CMs相较于同一批次接种在小鼠ECM上的hiPSC-CMs，表现出更明显的成熟特征，并在结构上出现差异。成熟的细胞呈杆状，而未成熟的细胞则保持圆形。

使用α-肌动蛋白抗体染色的心肌细胞显示出在每种ECM条件下培养的细胞典型形态。与肌钙蛋白I染色结果一致，α-肌动蛋白染色表明，在MECM上成熟的hiPSC-CM呈现出杆状成熟表型，并促进了更显著的肌节结构排列。在小鼠ECM与MECM上培养的细胞之间，线粒体含量和活性存在明显差异。

使用电压敏感染料（VSD）和光学标测系统记录的动作电位电生理数据显示，心房特异性细胞的自发搏动频率显著快于心室特异性细胞，且动作电位持续时间（即APD80）更短。针对APD80等参数的全孔板热图揭示了在同一块孔板内特定参数具有良好的可重复性。成熟的hiPSC-CM单层细胞的典型动作电位反映了已分离并检测的成年心肌细胞的动作电位形态特征。

还观察到典型的动作电位自发节律。在异丙肾上腺素作用下，β1-肾上腺素能受体的激活产生了正性变时性、正性变力性和正性松弛性效应。通过使用GCaMP6m钙荧光监测节律，研究了人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（HiPSC-CM）对人类Ether-a-go-go相关基因（hERG）通道阻滞剂（包括E-4031、多潘立酮、凡德他尼和索他洛尔）的反应。

该研究显示，由E-4031阻断hERG通道所引发的早后除极现象可被检测到。处理悬浮细胞时应迅速操作，并通过轻柔移液避免剪切应力。此外，更换培养基时应小心进行，以避免损伤hiPS细胞合胞体。

按照此操作步骤，可收集细胞中的蛋白质、RNA、DNA 和脂质，并用于研究者常用的技术分析。该技术使研究人员能够利用成年样心肌细胞研究疾病，并检测新药的心脏毒性。