磁性激活细胞分选介导的脂质囊泡亲和层析（LIMACS）：一种分析蛋白质-脂质相互作用的新方法

本实验旨在鉴定脂质结合蛋白，并在特定的膜环境中分析脂质与蛋白质的相互作用。将细胞匀浆中的脂质筏蛋白与新制备的磷脂酰丝氨酸和神经酰胺脂质体共同孵育。随后在反应体系中加入Xin V偶联的磁珠，以将与脂质体结合的蛋白质锚定在磁珠上。接着通过磁性激活细胞分选技术纯化蛋白质-脂质体复合物。

为了鉴定脂质结合蛋白的实验结果，可采用SDS-PAGE蛋白印迹法，展示在MDCK细胞中表达的内源性和重组型非典型PKC以及特异性神经酰胺结合结构域的lyx纯化结果。与现有的ELISA或表面等离子共振光谱等表面结合方法相比，该新技术的主要优势在于，脂质-蛋白相互作用是在类似膜的环境中实现的，且结合的蛋白质可被纯化并进行分析。该技术的应用前景涵盖涉及脂质相关疾病的治疗与诊断，因为在这些疾病中，生理性的脂质-蛋白相互作用受到损害。

对于其中一些疾病，其蛋白质靶点甚至尚未明确，需要进行鉴定。要设计一种基于脂质的疗法，首先准备脂质体，方法是将等摩尔量的磷脂酰丝氨酸与C16神经酰胺溶于100微升sical缓冲液中形成干燥混合物。加入300微升sical缓冲液后超声处理一小时，该缓冲液中添加有0.1毫摩尔/升氯化锰。在4摄氏度下以12,000 G离心20分钟，然后将大脂质囊泡沉淀重悬于100微升sical缓冲液中。加入1纳摩尔的vibrant cm DII荧光染料，在37摄氏度孵育一小时，以便在后续最大分离后可视化SLE组分。通过离心回收染有vibrant cm DII的磷酸盐-神经酰胺脂质体形成的粉红色沉淀，并将其重悬于100微升Tris缓冲液中。

接下来，为了制备无去垢剂的细胞裂解液，将细胞在300微升含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的10毫摩尔/升盐酸三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl）高渗缓冲液中进行超声处理，随后离心。为去除膜性碎片，将澄清的细胞裂解液加入脂质物理悬浮液中，并在4摄氏度下孵育两小时。由于细胞裂解液可能含有带磷酸乙醇胺的内源性膜结构，建议通过额外的离心步骤清除这些膜成分。

向反应体系中加入 20 微升 XNV 结合缓冲液和 50 微升含有与 XNV 偶联的磁珠的溶液，在 4 摄氏度孵育一小时，然后按照制造商提供的方案进行磁性激活细胞分选。接下来，使用微孔板荧光读数仪检测流穿组分和洗脱组分中的活泼 CM-DII 荧光，以确定抗体竞争实验中脂质小体的存在及其数量。为验证 PKC 与神经酰胺磷酸丝氨酸囊泡结合反应的特异性，将 1 微克抗 PKC Zeta 兔多克隆抗体与细胞裂解液在 4 摄氏度孵育一小时，随后与脂质囊泡孵育。

继续进行SDS-PAGE及免疫印迹分析，以检测最大洗脱液中与磷酸丝氨酸神经酰胺结合的蛋白质，用于体外重建脂质-蛋白质极性复合物。首先制备呈粉红色的沉淀，即之前所示的经活力染料CM-DII标记的磷酸丝氨酸神经酰胺囊泡。将囊泡重悬于100 µL的Tris缓冲液中，缓冲液中添加100 µmol/L γS-GTP、1 mmol/L GDP以及感兴趣的重组蛋白组合。随后在4°C条件下孵育反应体系3小时。接下来，加入5 µL的20×体外缓冲液储存液和50 µL的体外偶联磁珠。

将混合物在 4 摄氏度下轻轻振荡孵育 30 分钟。按照制造商提供的说明书继续进行 NX NV 磁性激活细胞分选，以促进沉淀。在洗脱组分中加入 10 µg 纯化的 e 白蛋白。

通过韦尔弗洛沉淀法浓缩蛋白质。下层相包含氯仿-甲醇，富含高浓度的vibrant cm dii。棕褐色的中间相含有磁珠和沉淀的蛋白质。

通过检测韦尔弗卢反应中氯仿-甲醇有机相内粉红色、明亮的 DiI 荧光信号，对细胞外囊泡中的脂质体进行定量。使用等量的脂质体以在各样本间标准化蛋白量，并通过 SDS-PAGE 进行分析，随后进行免疫印迹。

表达全长PKC Zetta（其C末端与绿色荧光蛋白或神经酰胺结合域相连）的MDCK细胞的无去垢剂裂解液。将PKC Zetta的C末端与磷酸丝氨酸孵育。

洗脱Max柱后，对鞘氨醇脂质体中的蛋白质进行免疫印迹分析。鞘氨醇结合片段C20 Zeta、EGFP和全长PKC Zeta均从Max柱的EIT中回收，表明lyx方法具有特异性和高效性。作为阴性对照的EGFP不与磷酸盐结合，在EIT中未检测到其与叙利亚鞘氨醇脂质体的结合。

当Linx与其他方法（如SDS-PAGE、蛋白质印迹或蛋白质组学分析）结合使用时，可以进一步回答更多问题，例如：哪些蛋白质存在于脂质结合蛋白复合物中。Linx开发之后，为单脂质研究领域的科研人员探索神经干细胞和上皮细胞中神经酰胺诱导的细胞凋亡及细胞极性奠定了基础。