基于β-葡萄糖醛酸酶（GUS）的细胞死亡检测方法

本实验的总体目标是利用 Gus 报告系统分析特定基因潜在的致死特性。将目标基因克隆至 Gus 表达盒中，并在 35S 启动子驱动下，通过相应的农杆菌载体在农杆菌菌株 LBA4404 中进行培养。随后，将这些载体与含有 Gus 表达盒的菌液混合，共同侵染尼克氏烟草（Nicotiana occidentalis）叶片。

可通过组织化学染色目视评估 Gus 活性，或通过荧光定量 mug 测定进行定量分析。与现有方法（如 DNA 梯状电泳或 TUNEL 测定）相比，该技术的主要优势在于，后者常用于哺乳动物系统，但在植物中难以重复；而本方法是一种灵敏、快速的基于植物的瞬时测定方法，其原理基于一个简单的事实：细胞存活是 Gus 表达发生的必要条件。今天演示该实验操作的是 Hua RAOs。

我们实验室的一名博士后研究助理指出，该侵染实验需要使用在25摄氏度下培养的三至六周龄烟草本氏烟（Nicotiana benthamiana）植株上充分展开的健康叶片。本实验计划在八天内完成。第一天，将含有细胞死亡检测载体的农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）甘油菌株以及含有Gus表达盒的载体菌株划线接种；当同时测试多个培养组合时，还需始终包含一个空载体作为阴性对照或填充对照。

将平板在28摄氏度下孵育两天。第三天，从每块平板上挑取单菌落接种至2毫升选择性LB培养基中。将每种培养物在28摄氏度、200转/分钟的振荡条件下孵育24小时，直至达到最大生长密度。

孵育24小时后，若出现菌体聚集，用移液器将培养物彻底重悬，并加入新鲜的选择性LB培养基，使每份培养物的总体积增至10毫升，以诱导农杆菌毒力基因的表达。加入丙酮至终浓度为25微摩尔，并在28摄氏度下振荡培养每份菌液16小时。下一步是将每份菌液在室温下以4,000 ×g离心10分钟，然后将沉淀重悬于10毫升浸润介质中。

不要添加丙酮，再次离心菌液，但此次用重悬缓冲液将每个沉淀重悬于5毫升含有100微摩尔丙酮的侵染培养基中。现在测量600纳米处的OD值。

浓度低至 0.1 是可接受的，但如果高于 0.9，则在浸润前用浸润介质和丙酮稀释至 0.9。在培养后，再次于 28 °C 条件下振荡培养三小时。将实验培养物与对照培养物按 1:1 比例与含有 Gus 盒的培养物混合。

对于每种培养物，使用一支1毫升无针注射器将ABA溶液注入密封处或新长出叶片的背面。渗透体积无需精确控制。当出现水浸状区域时，表明注入量已足够，此时在同一植株的相对两侧叶片上分别注入阴性对照和待检测基因，然后以相同方式再对另外两株植物进行渗透。

因此，每种培养条件对应三株植物。侵染后三天，即可采集叶片并检测GUS蛋白的表达。开始组织化学分析时，用X-Gluc底物对整片叶片进行真空浸润，直至叶片完全浸透。

现在，将叶片在室温下避光孵育过夜，或直至出现明显的蓝色染色。用蒸馏水冲洗叶片，然后将其置于70%乙醇中孵育过夜，直至叶绿素完全去除。第二天，用蒸馏水冲洗叶片，并检测GUS表达水平。

为了定量Gus表达，将底物mug转化为荧光产物mu，可通过以下步骤进行测定：首先在研钵中用液氮研磨浸润的叶片圆片。然后在保持样品处于冰上的条件下加入100 µL GUS提取缓冲液。接着在4°C下以14,000 ×g离心5分钟，收集含有总可溶性蛋白（包括Gus）的上清液。

使用NanoDrop测定总可溶性蛋白浓度，并用Gus提取缓冲液将每个样品的浓度调整至100微克总蛋白。然后，向每个样品中加入Gus提取缓冲液配制的mug底物，使终浓度为2毫摩尔mug。每个样品总体积为100微升，用移液器混匀后，在37摄氏度孵育反应1小时。

反应1小时后，加入800 µL GUS终止缓冲液以终止反应。为进行定量，将每份样品各100 µL加入微孔板中，在酶标仪中检测荧光，激发波长为365 nm，发射波长为455 nm，所得结果与标准曲线比较，GUS活性可表示为每分钟每微克总可溶性蛋白所对应的µmol产物量。根据所使用的构建体不同，可检测到不同的GUS表达水平；当GUS表达盒与细胞死亡负调控因子或抗凋亡基因共浸润时，GUS活性水平会发生相应变化。

相比之下，观察到较高的Gus表达水平。空载体对照组中的Gus水平则低得多。相反，当使用细胞死亡的正向调控因子或促死亡基因时，与空载体对照组相比，Gus表达显著降低。

一旦掌握，该技术可在大约一周内完成。在实施该操作时，需牢记此技术仅作为初步步骤，用于评估特定基因的潜在功能。后续还需开展进一步工作，以验证这些初步结果，并确定所涉及细胞的类型。