基于SA-β-半乳糖苷酶的筛选实验用于识别衰老细胞清除药物

本文首次描述了一种可用于高通量筛选对衰老相关疾病具有益处的衰老细胞靶向治疗化合物的药物筛选方法。事实上，目前已有多个基于该方法测试药物的临床试验正在进行中。该技术的主要优势在于，通过成熟可靠的衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-beta-Galactosidase）检测方法，能够区分两类衰老细胞靶向治疗药物——衰老细胞清除剂（senolytics）和衰老细胞表型调节剂（senomorphics）。

该技术是筛选新型抗衰老化合物的重要工具。事实上，通过该筛选方法已鉴定出多种化合物，这些化合物已被发表于多篇高影响力期刊，并且目前正处于临床试验阶段。该技术具有极高的通用性，可适用于多种高通量筛选体系。

事实上，可以对多个通路进行多重筛选，以筛选出通过激活或抑制若干通路之一来抑制细胞衰老的化合物。将每个胚胎切成一毫米大小的组织块，并用移液器反复吹打数次。接着，向每个胚胎的组织中加入10毫升培养基。

将它们接种于10厘米的培养皿中，在37摄氏度、3%氧气和5%二氧化碳条件下培养2至3天。将每个胚胎的其余部分与0.25%胰蛋白酶EDTA混合液在37摄氏度下孵育10分钟。消化细胞时，首先小心吸去生长培养基，用10毫升1×PBS洗涤细胞两次。

然后，向细胞中加入2毫升0.25%的胰蛋白酶EDTA溶液，在37°C条件下孵育2至3分钟。接着，在显微镜下观察细胞，确保细胞已从培养表面脱落。加入等量的生长培养基以终止胰蛋白酶消化，并将细胞转移至锥形管中。

然后，以200 × g离心细胞3分钟。弃去上清液，并加入新鲜培养基重悬细胞。接着，计数细胞，并按照预估的细胞密度将细胞接种至新的培养板中。

对于非衰老细胞的传代培养，首先将汇合的细胞按1:4的比例进行传代。然后在37摄氏度、3%氧气和5%二氧化碳的条件下培养细胞，以完成另一次传代。接下来，为诱导细胞衰老，将第1代汇合细胞按1:4的比例接种，并在37摄氏度、20%氧气和5%二氧化碳的环境中培养三天。

为了监测细胞衰老，使用先进的库尔特细胞计数系统，在每次胰酶消化步骤中测量细胞直径和细胞体积的逐渐增加。开始β-半乳糖苷酶筛选实验时，在96孔板中每孔接种5,000个衰老细胞或3,000个非衰老细胞。然后，向每孔加入100 µL生长培养基，并将细胞在37°C、20%氧气和5%二氧化碳条件下孵育6小时。

接下来，将药物稀释液加入MEF细胞中，在37摄氏度、20%氧气和5%二氧化碳条件下培养细胞24至48小时。培养结束后，移除药物溶液，并用100微升1×PBS洗涤细胞。为诱导溶酶体碱化，使用90微升巴佛洛霉素A1溶液（用新鲜细胞培养基稀释至终浓度为100纳摩尔）对细胞进行预处理。

然后，将细胞在37摄氏度、20%氧气和5%二氧化碳环境中孵育1小时。进行SA-β-半乳糖苷酶（SA-beta-Gal）活性的荧光分析时，用培养基新鲜配制C12FDG工作液，终浓度为100微摩尔。接着，向培养基中加入10微升该工作液，使终浓度为10微摩尔，并将细胞在37摄氏度、20%氧气和5%二氧化碳条件下孵育2小时。

用100微升1×PBS洗涤细胞。随后，加入2微升浓度为100微克/毫升的Hoechst 33342染料，使其终浓度为2微克/毫升。将细胞在37摄氏度、20%氧气和5%二氧化碳条件下孵育20分钟。

孵育后，移除培养基，加入100微升新鲜生长培养基，然后进行成像。在本研究中，一种高内涵荧光图像采集与分析平台可用于鉴定具有清除衰老细胞活性的药物（如17-DMAG），这些药物可降低含有第5代衰老细胞的鼠胚胎成纤维细胞培养物中的总体SA-β-半乳糖苷酶活性。该软件对衰老细胞与非衰老细胞混合物进行定量分析，能够清晰展示针对衰老细胞的特异性效应，并通过巴佛洛霉素A消除背景性的β-半乳糖苷酶活性。务必包含所有必要的细胞对照，特别是未经处理的衰老细胞以及经阳性对照处理的衰老细胞。

本实验涉及在氧化应激条件下培养原代细胞，这可能导致需要监测的变异。该步骤是检测衰老细胞清除药物的第一步。还需进行额外的细胞活力和细胞衰老实验，以确认筛选结果。

利用该实验已检测出多种新型衰老细胞清除药物，包括首个衰老细胞清除药物组合达沙替尼与槲皮素、热休克蛋白90抑制剂、Bcl-2家族抑制剂以及多酚类物质 fisetin。