DNA微阵列上用于流感的ampliPHOX比色检测

以下实验的总体目标是利用一种新型且快速的信号放大方法，在流感芯片——低密度微阵列平台上检测并表征流感病毒亚型。该方法通过引入生物素标记的DTPs，并使用5'端带磷酸基团的引物，对流感病毒RNA提取物中的基质基因片段和非结构基因片段进行扩增。PCR扩增后，通过酶切和片段化处理，生成短的单链、生物素标记的扩增病毒产物，随后将该产物与芯片阵列进行杂交。

FOX检测利用光聚合反应在杂交发生的位置生长出较大的聚合物斑点，并通过差异杂交模式来检测流感病毒亚型。该技术相较于标准荧光检测等现有方法的主要优势在于成本较低，且能够提供肉眼可见的快速结果，其分析灵敏度与荧光法相当。尽管如此，由于该方法是一种通用检测手段，可通过流感芯片为流感病毒的表征提供深入信息。

Ampl Fox 还可应用于多种其他系统，例如其他基于 DNA 和蛋白质的低密度微阵列。理论上，任何生物素化的产物都可使用 amox 进行检测。本次实验操作将由 Endeavor 公司的副科学家 Amber Taylor 和研究助理 Kevin Moulton 演示，他们在过去数年中均深度参与了 Fox 仪器及检测化学体系的开发工作。

使用病毒RNA提取试剂盒及厂商提供的操作步骤，从200微升病毒分离物中提取病毒RNA。用60微升洗脱液进行洗脱，将提取物于-70摄氏度或更低温度下保存以备后续使用。随后，按照试剂盒说明书在冰上配制反转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）预混液。

使用生物素标记的dNTP混合物，将含所示浓度的流感芯片引物混合物加入主混合液中。每对引物中应有一条引物在5'端含有磷酸基团，以促进酶切消化。流感A引物组扩增产物为1032个碱基对，流感B引物组扩增产物为811个碱基对。

短暂涡旋混匀，将18微升主混合液分装至薄壁PCR管中。然后向每根反应管中加入2微升RNA模板。将PCR管转移至热循环仪，使用具有合适退火温度的扩增程序进行扩增。

本实验所用的循环程序如图所示。按每份PCR反应加入2.2微升酶反应缓冲液、0.8微升无核酸酶水和1.0微升λ外切酶的比例，配制酶消化混合液。从PCR仪中取出样品，向每根PCR管中加入4微升混合液。

将样品放回热循环仪，设置热循环程序：37摄氏度孵育15分钟，随后95摄氏度孵育10分钟。接下来，在待杂交的微阵列周围安装一次性杂交腔室。然后将玻片置于110毫升纯化水中，在旋转摇床上清洗5分钟。

用纸巾轻轻接触孔的边缘，将玻片干燥。取22微升2×杂交缓冲液与片段化的单链DNA产物混合，短暂混匀后，移取40微升至微阵列孔中。将玻片置于湿盒中杂交1小时。杂交完成后，从湿盒中取出玻片，用2毫升洗涤缓冲液D短暂冲洗每张玻片，然后将玻片放入玻片架中。

接下来，使用旋转摇床将110毫升的洗涤缓冲液A和B分别加入不同的容器中。将载玻片架置于缓冲液A中，以60至90 RPM的速度振荡洗涤1分钟，此速度用于后续所有洗涤步骤。然后将载玻片架从洗涤缓冲液A中取出，并用洗涤缓冲液D短暂冲洗。将载玻片架转移至洗涤缓冲液B中，在旋转摇床上洗涤5分钟。

洗涤后，用纸巾轻轻擦干每张载玻片上的芯片，并将干燥的载玻片放入湿盒中。为进行四色荧光检测步骤做准备，为每个待处理的芯片混合10 µL扩增液、20 µL 2×扩增缓冲液和10 µL纯化水，将40 µL标记混合液转移至每个芯片上，并在密闭湿盒中反应5分钟。在杂交过程中，于容器中配制110 mL洗涤缓冲液C。标记完成后，立即用洗涤缓冲液D冲洗每个芯片。将每张载玻片放入载玻片架中，在旋转摇床上用洗涤缓冲液C洗涤5分钟；用缓冲液C洗涤后，将载玻片架在盛有纯化水的容器中短暂浸洗三次。

为去除盐残留，请按照之前所示方法将芯片干燥。将芯片存放在避光的载片盒中，直至进行光激活和成像，且应在24小时内完成。接下来，打开Amli Fox读取仪，并确保Amli View软件已准备就绪，以便在检测芯片样品前完成光激活。

首先，通过执行一个简短的校准程序，确定所有样本的最佳光激活时间。每天使用时进行一次校准，将Amplify溶液恢复至室温，短暂涡旋混匀，然后用移液器将三微升Amplify增强剂加入Amplify小瓶中，并充分涡旋混匀。每次仅对一张载玻片均匀施加40微升Amplify溶液，持续10秒，确保无气泡产生。

将微阵列芯片插入Amplify Reader的光活化槽中。在PL视图软件中选择“开始”，使用校准过程中确定的光活化时间启动光活化。完成后，用两毫升纯化水冲洗微阵列，以去除多余的扩增物。现在，在含有目标DNA的位点上已发生清晰的聚合物形成，但更易于观察。

染色后，让聚合物斑点干燥两分钟。然后在芯片上加入两滴Ampli Red试剂，继续染色两分钟。染色完成后，用纯化水快速冲洗载玻片，并按之前所示方法干燥，随后将载玻片插入Ampli Fox读板仪的成像舱中，使用amli软件采集图像并处理结果。左侧图像显示了Ampli Fox对2009年新型H1N1样本的检测结果。

尽管右侧图像使用共聚焦荧光微阵列扫描仪产生的传统荧光信号，但两种方法的整体检测模式均清晰可见。然而，Amli fox 的结果可直接通过肉眼观察到。这些图像展示了来自人类来源的 H3N2、人类来源的 H1N1、猪来源的 H1N1 以及一个未检测到流感病毒的阴性 fox 芯片阵列的荧光芯片检测结果。

图中蓝色标出的序列二和序列三对所示的所有甲型流感病毒亚型均产生信号，但右下角红色标出的序列仅对猪源性H1N1样本产生信号。阴性样本在绿色标出的内参序列上显示信号，表明RT-PCR反应无抑制或失败情况。

一旦掌握，从试剂瓶提取到氨苄西林检测及最终结果解读的整个流程可在大约六小时内完成。包括仪器校准在内的Ampli-Fox检测步骤，按照本方案操作可在约30分钟内完成。此外，还可进行部分或全基因组测序等其他方法，以回答更多科学问题。

该流感检测旨在作为初步筛查，尤其适用于产生独特杂交模式的样本。由于检测是一种通用型检测方法，我们希望研究人员能够发现新的、有意义的低密度微阵列应用，从而为检测技术带来附加价值。