活体成像观察斑马鱼发育过程中表皮细胞的挤出

上皮组织的维持需要在不破坏屏障功能的前提下持续清除受损和死亡的细胞。为实现这一过程，上皮细胞会通过在包围死亡细胞的邻近细胞中形成并收缩由肌动蛋白和肌球蛋白构成的环状结构，将死亡细胞挤出，同时闭合其退出后可能产生的任何间隙。在本视频文章中，介绍了一种实时诱导并成像斑马鱼幼鱼表皮中凋亡细胞挤出的方法。

如图所示，通过将红色荧光蛋白标记的F-肌动蛋白探针注射到表皮表达绿色荧光蛋白的单细胞阶段转基因斑马鱼胚胎中，以观察上皮组织中的肌动蛋白丝。在个性化处理后的第四天，选取同时表达GFP和RFP的幼鱼，用G418处理以诱导表皮细胞发生凋亡。通过转盘共聚焦显微镜进行延时成像，观察细胞挤压过程中肌动蛋白动态变化及上皮细胞形态的改变。

与现有的免疫力学分析等方法相比，该技术的主要优势在于，我们能够观察到活体上皮组织中细胞挤出过程中发生的快速变化和肌动蛋白动态。在本视频中，我们将向您展示一种实时成像斑马鱼发育过程中表皮细胞凋亡挤出的方法。我们实验室利用该方法研究细胞如何协调重组其肌动蛋白细胞骨架，以清除凋亡细胞，同时维持屏障功能，以及挤出过程的紊乱如何可能导致某些疾病状态。

接下来开始操作：为了观察斑马鱼发育过程中表皮细胞挤压时的肌动蛋白动态，首先将先前转录的RNA置于冰上解冻。我们转录编码红色荧光蛋白的mRNA，该蛋白与乌特罗菲蛋白（utrophin）的钙蛋白同源结构域及肌动蛋白结合蛋白相融合。按1:1比例向RNA中加入酚红，使RNA终浓度约为30纳克/微升，并通过反向填充将1微升溶液加入拉制的毛细玻璃针中。

在 E3 缓冲液中收集约 75 个单细胞期的 C-K-G-F-P 胚胎。使用 5 又 3/4 号帕斯塔移液管将收集的胚胎转移至显微注射模具中，并用 FST Dumont #5 镊子在凹槽中轻柔地调整胚胎方向，操作需迅速，以避免在标准实验室解剖立体显微镜下对多阶段胚胎进行 RNA 注射。

使用压力控制的显微注射器将RNA注入胚胎的卵黄中，以酚为化石。注射后，胚胎中应可见红色。每次实验务必至少注射50个胚胎。

筛选胚胎，去除未受精或受损的卵，并将所有剩余胚胎在28 °C条件下孵育。24小时后，使用荧光解剖显微镜挑选表皮中具有高水平GFP荧光以及RFP标记肌动蛋白荧光的斑马鱼胚胎。将选出的胚胎在28 °C继续孵育，直至准备进行药物处理以诱导暴露于氨基糖苷类药物后的细胞凋亡。

抗生素G four 18或药物可导致发育中的斑马鱼幼鱼表皮细胞发生凋亡性细胞外排。值得注意的是，该处理仅对受精后四天及更晚期的幼鱼诱导细胞外排有效。收集最多25条受精后四天、同时表达GFP和RFP的斑马鱼幼鱼，置于含有3毫升E three培养基的35 mm × 10 mm培养皿中。

小心地将培养基更换为 3 毫升含有 1 毫克/毫升 G418 的 E3 培养基，并在 28 摄氏度避光条件下孵育幼虫 4 小时。随后移除培养基，更换为预热的含 0.02% 三卡因（trica）的 E3 培养基，准备进行幼虫封片以用于成像。将最多 3 条幼虫转移至 1.5 毫升离心管中，并吸除大部分 E3 培养基。

使用剪切过的移液枪头，将 120 微升 1% 低熔点琼脂糖移入离心管中混合。然后轻柔地将幼虫与琼脂糖混合物移至 Matech 培养皿底部的盖玻片上。使用带有插针或连接钨针的 FST 针持器，迅速调整幼虫的方向，使其平直贴附于盖玻片表面。

让琼脂糖凝固，然后轻轻加入含有0.02%曲拉通的E3培养基。我们发现，凋亡细胞从发育中的斑马鱼幼鱼表皮排出的整个过程大约需要20分钟。

在此，我们演示如何使用转盘共聚焦显微镜及 Andor IQ 软件设置延时成像实验，以采集贯穿斑马鱼表皮单层的连续 Z 平面图像序列。首先，在 Andor IQ 软件中启动氩离子激光器、氦氖激光器、显微镜相机和落射荧光光源。创建一个时间序列实验方案，包含待成像的各波长参数。

根据设定的时间间隔频率进行图像采集，并重复采集指定次数。轻柔地将装有样品的Mattec培养皿放置在显微镜载物台上，使用20倍物镜配合透射光对焦到幼虫上。将40倍水浸物镜移至正确位置。使用该物镜，我们每视野可拍摄约20至25个细胞，既能追踪细胞在挤出过程中的行为，又能分辨亚细胞水平的肌动蛋白动态变化。

在40倍物镜顶部小心滴加一滴水，迅速将Mattec培养皿置于其上。先使用明场照明找到样本，然后使用488纳米的落射荧光，精确聚焦于GFP阳性的表皮。切换至共聚焦扫描模式。

根据每个通道的情况调整激光强度和曝光时间。注意平衡激光功率和曝光时间，以实现信号的最佳检测，并防止任何光毒性。为了识别突出的细胞，使用落射荧光观察标记了GFP的表皮，并识别出呈典型玫瑰花环结构的细胞群，即一组细胞围绕中央一个小的圆形细胞排列。

此外，应可见RFP标记的肌动蛋白在中央小圆形细胞周围聚集形成环状结构，这是细胞挤压的典型特征。一旦确定了正在挤压的细胞，应迅速设定Z系列的上下限及步长，然后开始采集四维共聚焦数据集，以观察数据并可视化肌动蛋白环的收缩以及围绕死亡细胞发生的上皮行为。

随时间推移，对Z系列图像生成三维投影，并将数据保存为视频文件。此步骤可使用多种软件包完成。该图显示了受精后四天的CK GFP斑马鱼幼鱼表皮中RFP UTR CH的表达情况。

此处显示的是来自延时电影的静止帧Z投影，用于追踪活体肌动蛋白的动力学过程。在上皮细胞挤出过程中，箭头指示的是邻近细胞形成的肌动蛋白环，该环在两分钟内逐渐收缩并闭合。通过此方法，我们可以将其与其他技术结合使用，例如化学抑制剂或基因突变，以更深入地理解细胞挤出过程的改变如何导致某些疾病状态。

由于未能清除凋亡细胞，我们刚刚向您展示了如何建立延时成像实验，以观察斑马鱼发育过程中表皮细胞的挤出过程。在执行该操作时，重要的是要注意限制样品暴露在光照下的时间，以防止发生光漂白或光毒性。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。