利用MG53介导的细胞膜修复可视化 体内 和 体外 系统

本实验的总体目标是评估动物体内及分离细胞的膜修复能力。收集分离的骨骼肌纤维，并将其置于含有FM 1-43染料的培养基中。随后使用紫外激光照射细胞膜的一部分，造成膜损伤，从而使染料进入细胞内。

将分离的细胞转染表达GFP MG 53的质粒DNA，该蛋白将定位于细胞的质膜和细胞质中。随后，将微电极的尖端插入C2C12细胞膜以诱导损伤。最终可获得结果显示GFP MG 53向损伤部位的转位。

该方法的可视化演示至关重要，因为掌握微电极穿刺和肌纤维分离技术需要经过实践训练。本次演示将由本实验室的实验室主管林博士、博士后研究员Wazu博士、研究生Matt Orange以及本系研究助理教授Shaza博士共同完成。实验开始时，先在跑步机下方放置一个托盘或蓝色实验垫，用于收集实验过程中动物产生的废弃物。

接下来，设置跑步机表面的倾斜角度。一些跑步机自带调节坡度的装置，而另一些则需要通过其他方式抬高跑步机来实现倾斜。通常使用水平平面，或7至15度的上坡或下坡角度。

将小鼠放置于跑台上进行适应，此时关闭电击网格，开启传送带驱动电机但不使其移动，适应15分钟后，打开用于激励的电击网格。以约5米/分钟的初始速度启动跑台，随后每分钟递增1至2米/分钟的速度，使动物进行5分钟的热身运动。

每天重复此热身过程 3 到 10 天，以提高测试期间的依从性。进行急性力竭运动时，随时间逐渐增加跑步机速度，直至达到最高速度，并密切观察力竭迹象。

当动物在跑台上停留时间少于一半，或在网格上连续停留五秒时，视为力竭。立即将力竭小鼠移除，并记录其总跑步时间。耐力训练。

跑步实验方案均以相同的热身程序开始。然而，最大速度通常较低，且跑步时间可能较长。测试结束后将小鼠放回其饲养笼，并用70%乙醇清洁跑步机。

从足部分离趾短屈肌的浅层组织以进行后续分析。首先，沿足底正中线切开皮肤，注意不要损伤下方的肌肉。接着，进行横向切口并去除皮肤。

辨认附着于跟骨的趾短屈肌（FDB）的扁平白色肌腱。用镊子分离肌腱，并在靠近附着处将其切断。切割时轻轻向上牵拉肌腱，同时去除任何结缔组织。

找到远端肌腱分支至各个脚趾的位置。在肌腱与深层肌肉连接处将其切断，并取出足底短屈肌（FDB）。将FDB肌束放入1毫升胶原酶溶液中，预先加热至37摄氏度。

将试管水平固定于37摄氏度的摇床培养箱中，以200 RPM转速振荡65分钟。消化充分的标志是组织呈现絮状外观和浅色。剪去1毫升移液器吸头的末端，以便消化后的组织团块通过。

将纤维束轻松转移至含有约 600 µL 2.5% 钙修饰台氏液的离心管中。轻轻翻转离心管，使纤维束中的松散纤维脱落。

接下来，剪切一个30微升移液器吸头的末端，使其直径仅略小于肌束。用此吸头将肌束吸入移液器，然后将其推回溶液中。重复此过程，直至大部分肌纤维从肌束中分离。

轻轻翻转离心管以混匀解离的纤维。取适量纤维滴加至玻璃底共焦培养皿中。将剩余纤维于4摄氏度保存约六小时，用于后续实验及其他研究。

将培养皿静置五分钟，不要扰动。这一步骤可使纤维黏附到培养皿的玻璃底部。将玻璃底培养皿置于配备紫外激光器的共聚焦显微镜上。

在相差显微镜下以超过100倍的放大倍数观察纤维，检查是否存在正常的横纹模式以及直杆状形态。向溶液中加入FM 1-43或FM 4-64染料，终浓度为2.5 µM。将纤维从视野的左上角至右下角呈45度角排列，以诱导损伤。

照射细胞膜上一个5×5像素的区域。使用设定为最大功率的紫外激光照射五秒，照射区域应横跨细胞膜，使5×5方框的一半位于纤维内部，另一半位于纤维外部。每隔五秒拍摄一次染料进入纤维的图像，持续记录最长五分钟。每皿最多照射三条纤维，因为荧光染料最终会被纤维通过内吞作用摄入，从而干扰数据分析。

使用三根纤维后，应准备一个新的培养皿。利用分析软件，计算约200平方微米区域内荧光强度的变化，以便在不同纤维之间进行比较。应对每一帧进行如下计算：ΔF除以F₀，其中F₀为第一帧中感兴趣区域的平均荧光强度，ΔF为后续每一帧中荧光强度的变化值。

采用标准方法将表达GFP MG 53的质粒DNA转染细胞。然后制备显微注射针。将一个派热克斯玻璃毛细管置于显微注射针上。

按照预设程序进行牵拉操作。将微量移液器连接至三轴显微操作器培养装置。从Delta T培养皿中移除培养基，并替换为2.5毫摩尔钙台氏缓冲液。

将含有转染细胞的培养皿置于配备40倍、1.3数值孔径油浸物镜的激光扫描共聚焦显微镜上。通过将微移液管插入细胞膜后迅速将其抽出，以诱导急性活细胞损伤。对肌钙蛋白诱导的膜破裂过程，以每帧1.54秒的时间间隔连续采集活细胞图像。

以每分钟约一毫升的速度，在成像细胞的上方直接灌注含0.005%肌钙蛋白的PERFU。跑步机可用于测量运动能力的下降。此处所示的MG53基因敲除小鼠由于骨骼肌损伤，其运动能力降低。

UV激光造成的损伤程度取决于所观察肌纤维的膜修复能力。这是一只正常小鼠在损伤前的肌纤维图像。此图像拍摄于200秒后，显示有轻微损伤。

来自膜修复能力受损的MG 53基因敲除小鼠的肌纤维在损伤后会表现出更显著的染料摄入。以下是一个未受损的转染了GFP-MG 53的C2C12成肌管的示例。此图像中的箭头指向含有GFP-MG 53的囊泡，这些囊泡正向损伤部位移动。

在此示例中，使用皂苷破坏质膜。注意损伤后GFP MG 53从细胞质向细胞膜的转位。进行此操作时，务必记住要分离出具有光滑肌膜和清晰横纹模式的良好肌纤维。

观看本视频后，您应充分了解如何评估肌肉细胞的膜修复能力以及细胞的培养方法。