可视化与定量内切酶介导的位点特异性DNA损伤

本方法学视频介绍了常用于研究DNA损伤相关细胞过程、以及可视化和定量参与DNA修复的蛋白质招募的免疫染色和染色质免疫沉淀实验的关键步骤。该技术为研究人员提供了强有力的工具，可用于鉴定结合于受损基因组位点的新蛋白，以及在DNA修复过程中精细调控所必需的蛋白翻译后修饰。由于这些技术可应用于研究多种细胞过程，因此在使用激光显微照射或基于细胞核的DNA损伤诱导系统时，具有潜在的重要意义。

近年来，已开发出多种强大的工具，可诱导位点特异性的DNA损伤，从而有助于加深我们对DNA修复机制的理解。通过应用生物化学与遗传学方法，这些工具在揭示DNA损伤位点处DNA修复复合物的招募与组装相关细胞事件方面至关重要。此外，这些技术还可在单细胞分辨率下，利用固定细胞和活细胞对这些过程进行研究。

将U2OS细胞在添加了10%胎牛血清、2毫摩尔谷氨酰胺和1%抗生素-抗真菌溶液的DMEM培养基中以单层形式培养。将细胞置于37摄氏度、含5%二氧化碳的湿化环境中培养，直至细胞融合度达到80%，每两到三天更换一次培养基。吸除培养基，并用PBS洗涤细胞。

使用胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞。当细胞脱落时，加入培养基以终止胰蛋白酶的消化作用，制备成细胞悬液。使用细胞计数板对细胞进行计数。

在24孔板中，每孔加入含有无菌12毫米圆形盖玻片的细胞悬液，每毫升接种20,000个细胞。将细胞置于37°C、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育24小时，使其贴附于盖玻片上。随后用10纳克/毫升的新制癌菌素处理细胞，或采用适当方法通过核酸内切酶系统诱导双链断裂。

在37°C、5%二氧化碳的湿化环境中孵育细胞1至8小时，以观察DNA修复的动力学过程。用4%多聚甲醛PBS溶液在25°C下固定细胞20分钟。移除固定液，用PBS洗涤细胞三次，每次5分钟。

移除 PBS，加入溶于 PBS 的 0.2% Triton X。将样品孵育 20 分钟。用 PBS 洗涤细胞三次。

用含5% BSA的BSA-PBST溶液封闭非特异性结合位点，孵育样品至少20分钟。将适量的一抗用1% BSA-PBST溶液稀释后加入。将每张盖玻片倒置放置于Parafilm上或10微升稀释抗体液滴中。

将样品置于湿盒中，4 °C 孵育一个半小时。将盖玻片正面朝上放回24孔板中，用PBS洗涤三次。加入用1% BSA-PBST稀释的适量二抗。

将每张盖玻片倒置在封口膜上，覆盖于10微升稀释抗体液滴上。将样本置于湿盒中，4°C孵育1小时。将盖玻片重新放回24孔板中，并用PBS洗涤3次。

在移除最后一次 PBS 洗涤液之前，用镊子和针的半部分轻轻取出盖玻片，然后将其倒置放在载玻片上，载玻片上已滴加封片介质液滴。染色质免疫沉淀是一种广泛使用的技术，用于鉴定蛋白质与 DNA 的结合模式。为了揭示目标修复蛋白在 DSB 周围的占据情况，使用特异性抗体从染色质样品中免疫沉淀目标蛋白及其结合的 DNA 区域。

此外，染色质免疫沉淀（ChIP）已广泛应用于绘制特定基因组位点处双链断裂（DSB）所涉及的特定翻译后修饰的存在情况。每个样本应在直径15厘米的培养皿中以每毫升约2000万个细胞的密度进行培养。移除培养基，并用预冷的PBS洗涤细胞两次。

使用1%甲醛-PBS溶液固定细胞。将培养板置于摇床上，轻轻振荡20分钟。加入甘氨酸终止固定，使其终浓度为125毫摩尔，并在25°C下于摇床上轻轻振荡孵育5分钟。

将培养皿置于冰上，用预冷的 PBS 洗涤两次。用预冷的 PBS 刮取细胞，并转移至 15 毫升锥形管中。在 4 °C 条件下以 5,000 rpm 离心 5 分钟。

小心吸除上清液，将沉淀重悬于两毫升细胞裂解缓冲液中，冰上孵育10分钟。在4摄氏度下以5,000 rpm离心5分钟。小心弃去上清液，将沉淀重悬于500至1,500微升核裂解缓冲液中，冰上孵育30至60分钟。

将裂解液转移至适合超声处理的聚苯乙烯锥形管中。对裂解液进行超声处理，使DNA剪切至平均片段大小为300至1000个碱基对。为预清除和免疫沉淀步骤准备Dynabeads磁珠。

用 RIPA 缓冲液在 4 °C 下洗涤磁珠两次，每次 10 分钟。将 Dynabeads 重悬于与步骤 3.1 中从原始储存液中取出的等体积 RIPA 缓冲液中。每个样品取 25 至 30 µg 染色质，加入 4 µL Dynabeads，在 4 °C 下旋转孵育 1 至 2 小时进行预清除。

将 Dynabeads 用磁铁沉淀，并将上清液转移至新的离心管中。向每份染色质样品中加入适量的抗体，4°C 旋转过夜。次日，向每份样品中加入 40 µL 洗涤后的 Dynabeads，4°C 旋转孵育过夜。

用300微升低盐缓冲液在4摄氏度下旋转孵育10分钟，洗涤一次。用300微升高盐缓冲液在4摄氏度下旋转孵育10分钟，洗涤一次。用300微升氯化锂缓冲液在4摄氏度下旋转孵育10分钟，洗涤一次。

用 300 微升 TE 缓冲液在 4 摄氏度下旋转洗涤 10 分钟，进行第一次洗涤，然后在 25 摄氏度下用 300 微升 TE 缓冲液再次旋转洗涤 10 分钟。向磁珠中加入 200 微升洗脱缓冲液，在 65 摄氏度下于恒温振荡器中孵育 15 分钟，并持续振荡。将上清液转移至新离心管中，并用 200 微升洗脱缓冲液再次洗脱磁珠。

加入终浓度为 500 微克/毫升的蛋白酶 K 和 0.5% 的 SDS，将样品在 50 摄氏度孵育 2 小时。进行氯仿抽提，将上层水相转移至新的离心管中。加入 2.5 倍体积的无水乙醇和 0.1 倍体积的 3 摩尔/升乙酸钠（pH 5.2）。

在负80摄氏度下孵育至少20分钟。去除乙醇并风干沉淀。将沉淀重悬于50 µL TE中。为研究它们在DNA上的特异性分布，应采用染色质免疫沉淀技术。

本图展示了通过ChIP-qPCR获得的典型实验结果，表明了γ-H2AX组蛋白在I-PpoI诱导的DNA损伤后的时序性富集。图像左侧显示了在DNA断裂位点处随时间变化检测到的γ-H2AX组蛋白信号，而右侧则展示了在未诱导断裂的对照基因区域中γ-H2AX组蛋白的分布情况。尽管DNA修复是一个相对较新的研究领域，但在生物化学和显微技术的共同推动下，我们对该领域的认识正在迅速增长。

然而，诸如蛋白质印迹、免疫共沉淀和质谱分析等生化技术需要大量细胞。研究修复过程仅能提供目标细胞群体的一个瞬时快照。显微技术领域已因高分辨率技术（如超分辨率显微镜）而发生变革，此类技术能够实现对核小体水平上由DNA损伤诱导的细胞过程进行可视化观察，同时确保蛋白质共定位的精确绘图。

另一方面，染色质免疫沉淀是一种强大的工具，特别是将其与测序方法相结合，可可视化特定DNA修复相关蛋白在染色质或异染色质区域中全基因组范围的结合模式，以及双链断裂的分布情况。