使用双光子激光显微镜的细胞膜修复检测方法

本实验的总体目标是定量评估肌营养不良症患者细胞的细胞膜修复能力。该方法有助于回答肌营养不良研究中的关键问题，例如特定基因突变与细胞膜重封动力学之间的关系。该技术的主要优势在于能够对活细胞中的细胞膜重封动力学进行实时定量分析。

首先，在含有40毫升培养基的T225培养瓶中，于37摄氏度的二氧化碳培养箱中培养成纤维细胞。当细胞培养至70%至80%融合度时，每次用40毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，随后加入5毫升0.05%胰蛋白酶，在37摄氏度下作用5分钟。当细胞脱落后，加入40毫升新鲜培养基终止反应，并将2毫升浓度为每毫升10万个细胞的悬液接种至35毫米胶原包被的玻璃底培养皿中，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下过夜培养。

每孔转染培养物加入150微升新鲜的无血清培养基至一个1.5毫升离心管中。然后向每根离心管中加入3微升转染试剂，在室温下孵育至少5分钟。在孵育期间，为每块培养板另取一个1.5毫升离心管，加入175微升含血清培养基和3.5微克dysferlin质粒DNA。

然后将每块培养板对应的150微升质粒DNA溶液与150微升转染试剂混合于一个新离心管中，室温孵育20分钟。次日早晨，将生长培养基更换为2毫升含血清培养基。孵育结束后，将全部300微升质粒溶液均匀分布至每块培养板中，并将培养板置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中继续孵育24小时。

第二天，将质粒上清液更换为新鲜培养基，将培养板放回培养箱中继续培养24小时。为进行双光子损伤实验，用1毫升Tyrode溶液冲洗转染后的细胞培养物一次，然后向细胞中加入1毫升新鲜Tyrode溶液，并添加1微升浓度为2.5毫摩尔的FM4-64染料。

接下来，使用倒置共聚焦显微镜，在显微镜软件中创建一个0.2 × 2微米的靶区，并将靶区置于细胞膜边缘，使靶区线段与细胞膜重叠且垂直。选择543纳米的氦氖激光激发FM染料信号，选择488纳米的氩激光激发GFP信号，并分别将检测范围设置为600至760纳米和500至550纳米。然后创建一个持续五分钟的连续图像扫描时间序列。

为制造细胞膜损伤，使用双光子激光器在时间序列开始后25秒，以820纳米波长、15%激光功率进行10次扫描以漂白细胞。为定量FM4-64染料的荧光信号，使用软件绘制一个6微米×6微米的兴趣区域，并将该区域放置在细胞内损伤位置附近。随后减去背景值，并将净荧光增加量除以零时刻的荧光值，以计算每个时间点的相对荧光值。

健康的成纤维细胞在激光损伤后表现出较低水平的FM4-64荧光激活，而未经处理的患者成纤维细胞在损伤后则表现出较高的相对荧光强度。转染全长dysferlin质粒的患者细胞与未经处理的患者对照组相比，其相对FM4-64荧光强度降低，且与健康对照组观察到的荧光值相似。在进行该操作时，需注意细胞在缓冲液中会逐渐死亡，因此操作应迅速，并定期更换新鲜细胞。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用双光子显微镜再生细胞膜损伤，以及如何实时定量分析细胞膜的修复过程。