使用肽免疫亲和富集联合质谱法进行蛋白质定量

以下实验流程的总体目标是从复杂的混合物中分离并定量作为相应蛋白质替代物的肽段。首先，利用胰蛋白酶等酶将混合物中的大分子蛋白质消化成其组成的肽段。然后，使用固定在蛋白G编码的磁性微粒上的抗肽抗体，对目标肽分析物和加入的稳定同位素标记内标进行富集，随后完成分离。

靶向肽段从磁性颗粒中洗脱后，通过质谱分析，相对于内标进行定量。该技术相较于传统免疫测定等现有方法的主要优势在于，建立大量检测方法时速度更快、成本更低。该方法成功率高，易于实现多重检测，相关操作步骤将在下文详述。

一名技术人员在实验室中将10微升血浆Eloqua置于湿冰上。将样品转移至1000微升深孔板中，并用封口膜覆盖，加入20微升新鲜的9摩尔尿素和30毫摩尔DTT至每个样品中，在37摄氏度孵育30分钟。向每个样品中加入3微升新鲜的500毫摩尔碘乙酰胺，并在室温下避光孵育30分钟。现在用100毫摩尔Tris（pH 8）将尿素稀释至0.6摩尔，并加入10微升浓度为1微克/微升的胰蛋白酶储存液，使酶与底物的比例达到1:50。

将反应在37摄氏度孵育过夜后，加入三微升纯甲酸，使其终浓度为1%，随后继续加入稳定同位素内标或多种内标。若进行多重检测，则用500微升含0.1%甲酸的80%乙腈溶液洗涤Oasis固相萃取板的小孔，弃去穿流液。然后加入500微升含0.1%甲酸的水溶液平衡固相萃取板，弃去穿流液。

将消化后的样品上样至柱板中，并调节真空压力使流速非常缓慢。用500 µL含0.1%甲酸的水溶液洗涤三次，弃去穿流液。再用500 µL含0.1%甲酸的80%乙腈溶液将肽段洗脱两次，然后将洗脱液冷冻干燥或真空离心浓缩至干燥，并将干燥后的肽段重新溶解于50 µL PBS缓冲液（含0.03% Chaps）中。将样品转移至标准的Kingfisher 96孔板，每种目标物加入1 µg抗体和1.5 µL蛋白G偶联的磁珠。在加入前需涡旋振荡磁珠。

为确保珠子充分悬浮，用铝箔覆盖酶标板，并在400 RPM转速下轻轻振荡孵育过夜。随后以400 RPM离心10秒，去除铝箔表面的液体。

移除铝箔盖。在 Kingfisher 自动化平台上进行样本操作。用 200 µL PBS 加 0.03% CHAPS 洗涤磁珠两次，再用 200 µL PBS 加 0.03% CHAPS 一比十稀释液洗涤一次，随后用 25 µL 5% 乙酸加 0.03% CHAPS 洗脱肽段。

将洗脱板置于磁铁上，小心转移洗脱液至96孔板中，注意不要转移残留的磁珠。用封板膜覆盖该板，将含有洗脱液的板送至三重四极杆质谱仪进行分析。通过获取目标肽段的串联质谱图，选择并优化最佳的跃迁碎片离子，从而建立MRM方法。

通常，多反应监测（MRM）分析采用C18捕获柱和分析柱，并使用两种流动相。上样10微升样品，通过线性梯度洗脱。积分轻链和重链肽段的峰面积，并计算每个样品中未标记肽段与标记肽段的峰面积比值。

轻链和重链肽段同时洗脱，且可对每种肽段监测多个跃迁离子对。为确认肽段身份，通过测量内源性肽段峰面积相对于内标物峰面积的比值，从而实现对目标肽段的定量分析。观看本视频后，您应能够充分理解如何在实验室中应用该技术。该技术可用于定量任何目标蛋白质，适用于生物研究中的广泛领域。