通过结构质谱分析大型蛋白质复合物

以下实验的总体目标是利用结构质谱法表征大型蛋白质复合物。首先制备镀金毛细管用于纳流电喷雾电离。第二步，制备样品并对质谱仪进行高分子量测量的校准。

接下来，优化实验条件以保持蛋白质复合物在气相中的完整性。然后采集质谱（MS）和串联质谱（tandem MS）谱图。质谱结果显示了对应于完整复合物质量的电荷态，而串联质谱实验则揭示了单体之间的结合模式以及去除了部分组分的复合物结构。

大家好，我是来自怀特曼科学研究所米龙实验室的 Naam Kiba，这位是 Isaac Ky，我也来自米切尔实验室。今天我们将向您展示通过结构质谱分析大型蛋白质复合物的基本流程。在我们的实验室中，我们利用这一流程来表征蛋白质复合物，以确定其化学计量、组成以及相互作用网络。现在让我们开始吧。

采用气喷电离技术对非流动的结合蛋白复合物进行分析，该技术使用Emme Plus或Qua毛细管。这种毛细管C可被拉制成直径约一微米的精细尖端，然后用金等导电材料进行包被。此类毛细管可直接购买获得，如图中所示。

然而，使用这种方法的成本要低得多。玻璃毛细管可以通过冷却并涂覆，从而制备成即用型针头，冷却步骤在此针头汇集装置上进行，而涂覆则在此涂覆装置上完成。开始该操作时，将两条双面胶带粘贴在培养皿底部，两条胶带相距两厘米。

将一根玻璃棒放置在其中一个垫片的中心位置。黏性垫片用于固定毛细管，玻璃棒则支撑已制备的毛细管，防止其尖端断裂。使用Boris硼硅酸盐玻璃毛细管，外径为1毫米，内径为0.78毫米。

将一根毛细管插入针头中，轻轻夹紧毛细管并调整其位置，使其位于加热灯丝的中心。轻轻拧紧夹具，直至毛细管两端均被牢固固定。使用此处所示的预设程序拉制毛细管。

然而，请记住，拉制仪的程序设置是一个反复试验的过程。在获得满意的尖端形状之前，每次拉制毛细管都会产生两根最终成型的毛细管。将拉制好的毛细管从仪器上取下，检查其尖端，丢弃任何变形或断裂的毛细管。

使用钝头定位镊子将毛细管放置在培养皿中。将毛细管底部连同粘附垫一起固定，并使上部倾斜靠在玻璃棒上，管尖朝上。持续拉伸毛细管，直至填满整个培养皿。

一个直径为10厘米的培养皿中大约可容纳80根毛细管。接下来，用金对毛细管进行镀膜。将载板插入金溅射镀膜仪中。

根据制造商的说明选择合适的气体供应，并启动预设的镀膜循环。重复镀膜三到六次，直至毛细管表面均匀呈现金黄色。毛细管准备就绪后，继续进行质谱仪的校准。

对MultiPro复合物开展的大多数实验均使用此类电喷雾四极杆飞行时间质谱仪进行。该仪器由Waters公司生产，并针对高分子量样品进行了改装。在上样蛋白质样品前，需使用碘化铯对质谱仪进行校准。

首先，用纯水配制浓度为 100 毫克/毫升的铯溶液，铯用于高质量校准，因为单电荷盐簇的质荷比范围很宽，从 393 到超过 10,000。使用钝头镊子从培养皿中取出一支涂覆毛细管，并向毛细管中加入 2 µL 铯溶液。

使用装有凝胶的吸头。将溶液向毛细管尖端滑动，可手动操作，也可使用离心适配器。将毛细管插入毛细管架中，并调整毛细管位置，使其尖端距离架体边缘约10毫米。

将毛细管置于光学显微镜下，使用尖头AA型镊子修剪尖端。必须确认毛细管内部无气泡，以免阻塞液体流动，并确保毛细管未堵塞。此外，需检查毛细管上的金涂层是否完好，未发生剥离。

如果出现这种情况，请更换毛细管或修剪尖端并去除未涂层部分。接下来，将毛细管支架连接至纳米流电喷雾电离（ESI）接口。旋转XY、Z轴载物台向后移动，以避免损坏毛细管，并将载物台推至其激活位置。

毛细管应置于距锥孔一至十毫米的位置。施加毛细管电压和低纳米流速压力，直至产生喷雾。随后尝试将纳米流速压力降至最低值。

通过调整 XYZ 载物台的位置、毛细管电压、纳流压力和去溶剂化气流来优化信号强度。为了检测宽质量范围的色谱峰系列，应优化加速电压。此处使用的参数为：毛细管电压 1.3 至 1.7 千伏，样品锥 80 至 150 伏，提取锥 1 至 3 伏，以优化高质荷比离子的传输，后者需要温和的去溶剂条件。

在源与分析器之间的初始真空阶段，背压升高至5至6毫巴。为提高背压，需在监测信号强度变化的同时，通过部分关闭隔离阀，谨慎降低源真空管路至涡旋泵的导通率。在完成质谱仪的设置后，以每秒一次扫描的速度，在母离子电荷比范围为1000至15,000的条件下采集约30次扫描，随后使用适当的校准表对飞行时间进行校准。

校准完成后，即可上样蛋白质样品。样品需在质谱仪校准前进行制备，所需浓度为低微摩尔浓度。如有必要，可使用离心超滤装置浓缩样品。

使用前需确认蛋白复合物未吸附至装置膜上。由于仅能使用挥发性溶液进行NESI，通常需要更换缓冲液，此时可通过检测体积和紫外吸收来验证。可使用微型离心凝胶过滤柱去除盐类、缓冲液分子或任何其他非挥发性添加剂的残留。

相反，将样品悬浮于醋酸铵水溶液中。这一关键步骤决定了谱图的质量。

重复缓冲液置换操作，最多三次，每次稀释倍数最小化，低于1.3倍，直至达到最大置换效率。如果同时需要浓缩和缓冲液置换，可采用离心超滤法一并完成，方法如本节开头所示。接下来，按照碘化铯校准的示例加载样品，并启动喷雾。

首先进行喷雾条件的初步优化，直至检测到信号。使用所示的平均电荷态计算公式，其中 M 为复合物的质量（单位为道尔顿）。然而，电荷态的确切位置取决于蛋白质。

为防止复合物解离，请勿加热铁源。应关闭加热器或将温度保持在40摄氏度以下。调节毛细管位置、样品锥和提取器电压。

为了最大化铁的传输效率，可将锥孔电压设为100伏、提取锥电压设为1伏、毛细管电压设为1.5千伏作为可能的起始条件。检查光谱发生的变化，并结合纳米流体压力优化这些参数，以提高去溶剂化效果，并去除残留的水和缓冲液成分。

逐步增加碰撞池中的气体压力和偏置电压。典型的偏置电压范围为10至100伏，离子阱气体流速为每分钟1至10毫升。操作时需谨慎，以防止复合物发生结合，同时调节离子阱和传输过程中的碰撞能量。

通常需要较高的电压，一般在10至30伏范围内，以实现高质量离子的传输。此时，重要的是避免如图所示的复合物发生碰撞诱导解离。当信号达到稳定后，建议在保持稳定喷雾的同时，将纳流压力和毛细管电压降低至最低值。

在收集多个扫描数据后，通过串联质谱法鉴定复合物的组分。当获得蛋白质复合物的最优且稳定的信号后，选择前体离子并设置隔离宽度中的质荷比中心。通常采用较低的质谱分辨率12，以及较高的质谱分辨率13至15，先使用较宽的质荷比范围以检测高质荷比、低电荷的解离产物，随后将其调整至所需数值以进行质谱分析。

通过逐步提高碰撞能量（简称 CE）以及碰撞池内的压力，使前体铁离子解离。以 10 至 20 伏特为步长，逐步增加离子阱或传输过程中的 CE，并将碰撞气体压力升至每分钟 0 到 5 毫升。持续监测质谱图的变化，直至达到最佳激活条件。较高的激活能量可能促使完整复合物中的一个或多个亚基发生解离，从而揭示不同亚基之间的相互作用亲和力。

选择多个电荷态进行二级质谱分析。当存在组分重叠时，获取一组串联质谱图有助于解析不同群体的电荷系列。此外，相较于低电荷态，高电荷态更容易发生解离，可结合一级质谱与二级质谱进行分析。

通过质谱（MS）分析来验证所选前体离子的分离效果。除了对完整复合物进行质谱（MS）和串联质谱（ms）表征外，还可在温和变性条件下生成较小的亚复合物，并对这些亚复合物进行同样表征。

亚复合物的质谱（MS）和串联质谱（ms MS）分析是确定复合物亚基结构的基础。为了逐步部分破坏亚基间的相互作用，可逐步加入有机溶剂，浓度最高达50%，或通过加入氨水或甲酸调节溶液pH值，甲酸浓度最高达4%。最后，为了确定构成复合物的各个亚基的质量，必须在变性条件下获取质谱图。此步骤可使用Zip Tip C4进行，洗脱溶剂采用25%至75%的水-乙腈混合液，并添加1%甲酸；所有数据的采集、处理与结果分析均应按照随附的书面实验方案详细进行。在加载蛋白质复合物样品前，需使用碘化铯对质谱仪进行校准。

标记为红色的一系列等间距峰分布在很宽的范围内，从393的主电荷比延伸至10,000以上。这些峰被指认为具有铯加复合物通式的单电荷盐簇。在黑色标记的主要峰之间出现的额外信号，则由该系列中铯二加复合物和铯三加复合物的双电荷及三电荷物种引起。

在初始真空阶段提高压力对于检测高质量数团簇至关重要。此处通过1.2和5.3毫巴的压力读数展示了压力对高质量数峰的影响。较高压力下的质谱图在此处显示为放大图。

以下是一个凝集素变体复合物的质谱分析示例，其产生的质荷比电荷态分布在3000至5,000之间。然而，由于离子脱盐不充分，峰形较宽。将偏置电压从4伏特提高到15伏特，增强了加速条件，导致残余的水分子和缓冲液成分被去除，从而获得高分辨的谱图，测得的质量对应于五聚体复合物。

随后选择+15电荷态进行串联质谱分析。随着碰撞能量的增加，释放出一个高度带电的单体，其中心位于1,664质荷比处，同时产生一个去除了配体的四聚体复合物，其质荷比范围为5,000至8,000。在变性条件下也对凝集素变体复合物进行了检测，结果导致复合物发生缔合。

通过这种方法，可以确定构成复合物的各个亚基的精确质量。我们刚刚向您展示了如何获取高质量离子的质谱（MS）和串联质谱（MS/MS）谱图。在进行此操作时，重要的是要正确制备样品，并仅使用与质谱兼容的挥发性缓冲液。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。