利用原子力显微镜对肺组织进行微机械特性表征

以下实验的总体目标是通过使用原子力显微镜微压痕直接测量新鲜镜像肺组织的局部弹性特性，在与驻留细胞相关的空间尺度上表征肺实质的局部机械环境。这是通过用剃须刀或手术刀刀片切割 agarro 膨胀的小鼠肺组织以制备长度和宽度为 5 x 5 毫米、厚度为 400 微米的肺实质条来实现的。接下来未固定的未渗透肺组织条是免疫染色，它识别 FM 微压痕的感兴趣区域。

然后在室温下在 PBS 中的组织条上进行 FM 微压痕。为了直接测量新鲜肺组织的局部弹性特性，可以获得结果。这表明正常和纤维化肺实质中组织刚度的范围和分布存在显着差异，刚度的空间变化很大，尤其是在纤维化肺样本中。

基于从使用 FM 微压痕获得的受迫位移曲线中提取的刚度图。与组织条拉伸等现有措施相比，该技术的主要优点是它提供了前所未有的空间分辨率，为组织刚度的微尺度变化提供了独特的视角。该测量可以帮助回答关键问题，例如组织内的刚度在空间上如何变化，以及疾病中刚度变化的范围和空间尺度是什么。

导致组织重塑的过程 要准备肺组织条带，首先要通过给孤立的小鼠肺充气来稳定肺结构以进行切割。气管内用每公斤体重 50 毫升的 PBS 制备的温热的 2% 低凝胶点 aros 绑住气管，并在 4 摄氏度的 PBS 浴中冷却膨胀的肺 60 分钟。aros 将在空气空间中凝胶和变硬，以轻轻稳定肺结构 在此期间，使用剃刀或手术刀将 aros 稳定的小鼠肺组织切成长和宽约为 5 x 5 毫米、厚度约为 400 微米的条状。

然后在 37 摄氏度的 PBS 中清洗试纸 5 分钟，以去除残留的 aros，以排除大气道和血管。如果要对大血管中的气道进行成像，请从远离主支气管的胸膜下区域切开条带，从离主干支气管更近端的肺组织中切开条带，以隔离 FM 微压痕的感兴趣区域。通过面部造影显微镜或免疫染色观察组织，并通过荧光显微镜观察

有关程序，请参阅本协议的书面部分。在 FM 表征之前，从漂浮组织下方抬起盖玻片，将组织条连接到聚 L 赖氨酸包被的 15 毫米盖玻片上，确保组织条均匀分布在盖玻片表面上。如有必要，用第二张干净的未涂层盖玻片夹住条带，并施加轻微的压力以帮助组织附着到聚 L 赖氨酸涂层盖玻片上。

每轮微压痕实验之前，立即按照制造商的说明校准 A FM 系统。为此，请确定两个关键参数。使用空气中的热波动法的悬臂弹簧常数和悬臂偏转灵敏度，该参数用于将光电二极管输出信号缩放到实际悬臂偏转距离。

通过在干净的载玻片上获得 PBS 中的标准强制位移曲线来校准偏转灵敏度。然后计算受迫位移曲线测量中受迫位移曲线的斜率。A FM 尖端在单个位置向样品表面伸出和缩回，悬臂的偏转 delta D 作为尖端位移 delta 的函数进行监测 Z.It 建议使用直径为 5 微米的硅酸盐球形尖端的氮化硅三角悬臂，使用弹簧常数为每米 0.06 牛顿的 FM 探头。

我们对软材料进行了机械表征，其纯粹调制范围为 100 至 50， 000 帕斯卡。用薄纸擦拭样品盖玻片的底面，然后用真空润滑脂将其固定在标准载玻片上。将载玻片安装在 A FM 样品台上，并用 500 微升室温 PBS 覆盖组织。

然后将 FM 扫描头放在样品上。调整显微镜样品台，将显微镜设置为目镜观察，以将 A FM 尖端对准视场中心。移动 A FM 样品台以选择组织上感兴趣的区域。

然后切换到 CCD 相机查看以根据需要记录组织的相差图像和/或荧光图像。缓慢向下移动 A FM 尖端，直到它与样品接触准确。软样品的 FM 微压痕表征需要较小的压痕深度以避免大的局部应变，这会使用于弹性模量计算的赫兹模型无效，以避免大应变，通过将悬臂最大挠度设置为 500 纳米在触发模式下执行压痕。

此偏转限制会将最大压痕力限制在 30 纳牛顿以下。压痕速度应选择足够慢，以探索软样品的弹性而不是粘弹性。为肺组织选择 2 至 20 微米/秒的速度范围，以便从感兴趣区域进行单次测量。

将 A FM 探头移动到感兴趣的位置并执行单个压痕以收集标准力位移曲线。探头将仅在 Z 方向上移动。要自动映射感兴趣区域，请切换到强制映射模式，选择所选区域内的扫描大小和采样点。

A FM 尖端在压痕运动之间穿过样品表面，并在独立定义的样品网格内的每个点收集单独的强制位移曲线。我们发现使用 16 x 16 的样品网格以每秒 20 微米的压痕速度绘制 80 微米 x 80 微米的区域是可行的，这可以在大约 10 分钟内完成。为了计算杨氏模量，使用李方的非线性曲线拟合将力位移曲线拟合到赫兹球形压痕模型，如图所示，其中 F 等于 K，sub C 乘以 delta，D 是弯曲悬臂的力。

K sub C 是悬臂弹簧常数。R 是球尖半径 delta 等于 delta Z 减去 delta D 是压痕，new 是样本泊松比，等于肺组织的 0.4。要评估拟合质量，请在非线性曲线拟合期间计算 SSR 值或数据与拟合值之差的平方和。

通过丢弃具有较大 SSR 值的不良曲线中的数据，消除不可靠或无法解释的测量结果。如果需要，将弹性模量或 E 转换为剪切模量。G.使用关系 E 等于 1 乘以 1 加 new times 的两倍 G.To 可视化在力图模式下收集的刚度空间模式，绘制模量数据和等值线图，例如，在覆盖 80 微米 x 80 微米区域的 16 x 16 网格中。

为了处理大量的力曲线数据，可以编写自定义算法来自动拟合力位移曲线，提取模和/或绘制等高线图或 ELA 嫁接。使用刚才描述的相同程序和参数，该图显示 Im 正确切割和染色组织。肺实质的肺泡微小保存完好，通过免疫荧光染色观察到基底膜成分层粘连蛋白，没有固定或渗透。

这些面板显示了胶原蛋白的免疫荧光染色，一种在新鲜未固定的肺中，该染色是从先前用 PBS 处理或用 blio mycin 处理以诱导纤维化的小鼠收获的。此处显示了从 FM 微压痕中获得的样本力位移图，具有相同的施加力。A FM 尖端在柔软区域产生大压痕，导致相对平坦的力位移曲线显示为蓝色，而较硬区域的压痕则为小压痕和陡峭的力位移曲线，显示为红色。

为了在每次压痕后获得干净的力曲线，在下一次压痕之前，需要将 A FM 尖端从样品表面完全缩回并且没有接触。这种接触自由状态对应于曲线的平坦区域，尖端在该区域平移而没有悬臂偏转。该图显示了一个典型的没有平坦区域的假曲线，当针尖没有完全从样品表面缩回时，例如当软样品附着在针尖上时，就会发生这种情况，如果针尖完全困在软样品中，则无法确定接触点。

曲线可能看起来像这样，没有明显的偏转，但噪声很小。此图显示了刚度。从强制位移曲线中提取的数据在空间上显示为称为 ELA 移植物的刚度图，其中具有刚度的 ELA 移植物的色标显示出正常和纤维化肺实质中组织刚度范围和分布的显着差异，以及刚度的巨大空间变化，尤其是在纤维化肺样本中。

看完这个视频后，你应该对如何通过使用原子力显微镜直接测量新鲜肺组织的局部弹性特性来表征肺实质的局部机械环境有了很好的了解。