慢病毒介导的嗅觉感觉神经元遗传操作与可视化 体内

神经科学领域研究发育过程的一个挑战是在活体中以单细胞水平捕捉树突和轴突的形态。在嗅觉系统中，嗅觉感觉神经元从鼻腔内的嗅觉上皮延伸其轴突至大脑中的嗅球。当多个嗅觉感觉神经元向嗅球投射时，它们会聚集成束。

这使得单根轴突的投射路径及其终末形态的研究变得复杂。我们开发了一种方法，通过显微注射携带GFP构建体的慢病毒，以在体内可视化单个嗅觉感觉神经元。

使用慢病毒成功转导可照亮整个嗅觉感觉神经元轴突长度，包括其终末分支。除了可视化单个嗅觉感觉神经元外，该方法还允许我们操控特定目的基因的表达，以研究其在活体环境中的功能。此慢病毒操作属于生物安全二级实验，需在层流罩中进行。

为保持无菌环境，将所有放入生物安全柜的物品用70%乙醇喷洒；在注射前至少20分钟，准备并预热37摄氏度的水浴床。用塑料密封袋装入半袋水并封口，然后将其置于空的加热块培养箱上。

这将使小鼠在注射后得以恢复。用10%的漂白剂填充生物危害废物容器，以对所有接触过病毒的物品进行去污处理。在此过程中，准备一个盛有70%乙醇的小型敞口培养皿和另一个装有无菌蒸馏水的培养皿。

在超净工作台中，我们将使用一支容量为5 µL、带有33号针头的汉密尔顿注射器。该特定型号可通过调节位于活塞腔顶部的张力旋钮来调整活塞的阻力。此功能可实现显微注射体积的控制，并对针头及注射器腔体进行灭菌。

反复从培养皿中吸取并推出乙醇数次。通过反复吸取和推出无菌水清洗注射器套件。将注射器安全放置于生物安全柜中备用。

在注射工作站附近放置酒精棉片。准备一个注射平台，提供一个抬高的表面，便于小鼠的定位。可以使用倒置的直径10厘米的培养皿，并用Kim棉片覆盖。

在断奶前，可通过低温使小鼠幼崽麻醉。剪下橡胶手套的一个指套，将小鼠幼崽放入该指套中，然后置于冰上五分钟。

手套可防止皮肤直接接触冰块测试时可能引起的冻伤。通过捏压幼崽的后肢和四肢足部，检查是否完全麻醉，确保动物无反应。现在我们已准备好进行慢病毒的显微注射，将以新生幼崽为例进行演示。

若使用年龄较大的小鼠，应将33号针头替换为更粗的针头，以穿透颅骨表面。用酒精棉片擦拭小鼠鼻部表面进行消毒。从冷冻保存中取出慢病毒原液，并在冰上解冻。

我们已在实验室内部使用既定方法自行制备慢病毒。在开发该方法的过程中，我们发现要实现良好的转导效率，慢病毒的最低滴度需达到每毫升10的9次方个感染单位。用无菌Hamilton注射器吸取2 µL慢病毒原液。

将小鼠幼崽放置在注射台上。抓住耳部上方头部的皮肤，轻轻向后拉。我们在超净工作台中配备了体视显微镜。

为了准确定位微量注射，在前脑的背侧颅骨表面寻找嗅球的轮廓。我们的微量注射位点应紧邻嗅球周围，但不应包含嗅球本身。对每只幼鼠的嗅上皮进行四次注射。

以蓝色圆点表示的这些位置要求将针头以朝向内侧的角度插入。另外两个以绿色圆点表示的注射位点呈交错排列，位置更靠内侧且位于嗅球前方。这些注射可以以倾斜的角度进针。

针头角度的建议是基于嗅上皮的腹侧位置而提出的，因为嗅上皮主要位于嗅球下方，限制了垂直进入的路径。应将针头从鼻腔顶部插入，位置约为皮肤表面下3毫米处。

以到达嗅上皮。当操作者的手感觉到鼻腔管腔空间阻力下降时，表明已到达该区域，应避免在此处继续操作。

每个位点显微注射0.5 µL病毒储存液。同样选择每侧两个位点，左右两侧共四个位点，总计注射4次，每次0.5 µL。每只小鼠单次注射共需2 µL病毒。

再次注意，不要将嗅球残留的任何病毒溶液或从注射部位或鼻孔溢出的血液抽干。使用乙醇擦拭纸后，将擦拭纸丢弃至稀释的含氯消毒液容器中，并立即将注射完成的小鼠放置于水浴孵育箱中进行恢复。通过重复准备阶段所进行的消毒程序，对针头和注射器进行去污处理。注射后的小鼠在水浴孵育箱中恢复30分钟，即可放回笼中。

整个显微注射过程可在四小时后重复进行。如果希望增加被感染的嗅觉感觉神经元数量，可在短短三天内观察到被感染的嗅觉感觉神经元遍布整个细胞。在预期的时间点处死动物并进行灌注以供观察。

为了可视化转导的单个嗅觉感觉神经元的投射轨迹及其轴突末端，我们采用标准方法对嗅球进行冠状切片，切片厚度为60微米。该切片将包含嗅球的所有细胞层，包括嗅觉感觉神经元的轴突束及其轴突终末。这些轴突终末在位于嗅球表面的肾小球结构中形成突触，为后续漂浮免疫组织化学染色做好准备。连续切取嗅球切片，并用5毫升磷酸盐缓冲液将切片依次收集至直径10厘米的培养皿中。

将漂浮的切片转移至一个50毫升的锥形瓶中。待切片沉降至瓶底后，用抽滤法除去磷酸盐缓冲液。注意不要将切片抽走。

用10毫升新鲜缓冲液对组织切片进行补充，以洗去残留的固定剂或包埋材料。立即将重悬液用移液管转移至一个15毫升的锥形管中，确保收集所有漂浮的切片，抽去清洗液，然后加入含有0.3% Triton X-100的磷酸盐缓冲液，将切片置于摇床上，室温下振荡孵育10分钟。随后可在同一锥形管中按照标准免疫染色流程继续操作，根据该规格容器的需要重复抽吸和摇床步骤，并在染色和清洗步骤中保持10毫升的液体体积。

以下是用于共染色已成功转导的嗅觉感觉神经元以及普通嗅觉感觉神经元群体的一系列抗体。为了确保抗体充分渗透60微米厚的嗅球切片，建议在4摄氏度下孵育过夜。每次洗涤的深度不应少于20分钟。

用画笔将每个切片轻轻铺展在玻璃载片上，用添加了染色质染色液的FloraMount G封片剂对每张载片进行封片。应尽量去除封片介质中的所有气泡。将切片以行列形式排列封片，以简化后续的筛选步骤。

在免疫染色的嗅球切片上扫描 GFP 阳性的轴突纤维及末端。使用荧光显微镜，可通过共聚焦显微镜成像观察到阳性感染的神经末梢。建议使用 DPI 和嗅觉标志蛋白通道对感兴趣区域的焦平面进行校准。

这些结果展示了一个嗅觉感觉神经元的单根轴突纤维及其在肾小球内的轴突终末，其中CO（嗅觉标志蛋白）呈红色，而vlu2呈灰色。如果在解剖和免疫染色步骤中包含了该组织，则可在嗅觉上皮内观察到被感染的嗅觉感觉神经元胞体及其树突末端膨大。该共聚焦投影为我们提供了单个嗅觉感觉神经元轴突延伸路径及其终末分支结构的极为详细的形态学信息。可以清楚地看到轴突纤维向其靶向肾小球回钩的现象，以及其在肾小球神经网内分支模式的细节。

慢病毒显微注射方法可实现单细胞轴突的可视化，以及嗅觉感觉神经元形态的观察，并可用于研究基因表达的调控。慢病毒转导可使载体稳定整合至基因组中。慢病毒不会通过突触感染邻近细胞。注射后仅需三天即可实现可视化，且该信号至少可维持三个月，甚至可能持续更长时间。

嗅觉感觉神经元不易通过鼻腔灌注慢病毒溶液实现感染。因此，本实验需要通过表面进行显微注射。这就是我们的慢病毒显微注射操作步骤。

希望以上信息能助您成功获得单细胞形态。祝您探索顺利！