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外泌体是由细胞分泌到生物液体中的细胞外囊泡结构。为了从生物液体中捕获特定的外泌体,首先取试管中的链霉亲和素包被磁珠。
向该管中加入生物素标记的抗人抗体。抗体上的生物素对磁珠上的链霉亲和素具有高亲和力,从而导致抗体与磁珠发生偶联。
接下来,向含有抗体标记的磁珠的试管中加入富含蛋白质的封闭液。封闭液中的蛋白质会结合到磁珠的游离位点,从而提高外泌体结合的特异性。
现在,向试管中加入富含外泌体的样本生物流体。将试管置于振荡条件下孵育。生物流体中的外泌体表达特定的表面受体,这些受体有助于外泌体与连接在磁珠表面的抗体结合。
接下来,将试管置于磁场中。在磁场作用下,结合外泌体的磁珠会吸附在试管内壁表面。然后,使用微量移液器吸除试管中剩余的生物流体。
最后,将离心管从磁场中取出,并加入适当的缓冲液以洗脱与外泌体结合的磁珠。这些与外泌体结合的磁珠可用于后续的下游分析。
重悬含有链霉亲和素包被的磁性微粒、浓度为每毫升10微克的储存液,取5微升该溶液加入含有495微升磷酸盐缓冲液(PBS)的微量离心管中。洗涤微珠时,首先将离心管置于磁力架上1分钟,小心移除上清液,注意不要扰动微珠。
然后,将离心管转移至非磁性架上。加入500 µL PBS,用移液器吹打洗涤磁珠,共洗涤三次。最后一次洗涤后,将磁珠重悬于490 µL PBS中,再加入5 µL生物素标记的小鼠抗人CD63抗体(来自1 mg/mL的储存液)。
用移液器混匀溶液。将样品旋转仪程序设置为在90度下往复旋转5秒,并在5度下振动1秒。将试管放入旋转仪中,在室温下运行程序30分钟。
接下来,将离心管置于磁力架上静置5分钟。用500 µL PBS洗涤磁珠三次,然后将其重悬于含有酪蛋白的490 µL PBS中。用样本编号标记一个离心管,然后加入10 µL样本。
用移液器反复吹打数次,使样本与抗体偶联的磁珠充分混匀。接着,将离心管转移至样品旋转仪,于室温下运行相同程序2小时。然后,使用磁力架,用500微升1M Tris-盐酸缓冲液洗涤磁珠三次。此时,外泌体已结合在磁珠上。