从人胆汁中分离和分析含微小RNA的外泌体

本方法的总体目标是从人胆汁中分离外泌体，用于后续分析，包括微小RNA谱型分析。该方法有助于解答肝病领域的一些关键问题，例如胆管癌或其他胆道疾病中特定胆汁标志物的检测。该技术的主要优势在于其具有良好的稳健性和可重复性。

进行内镜逆行胰胆管造影术（ERCP）时，首先将患者置于仰卧位。经插管后，将十二指肠镜经患者口腔送入，推进至十二指肠第二部分，找到主乳头。使用预先插入直径为0.35英寸或0.9毫米亲水性导丝的三腔切开刀，选择性地插入胆总管进行插管。

在荧光透视引导下，将导丝推进至左肝管，然后将切开刀沿导丝推进至胆管内约五厘米处，以获得稳定位置。取出导丝后，通过下端锁将一个10毫升注射器连接至导丝端口，利用10毫升负压抽吸胆汁。移除含有胆汁的注射器，重新插入导丝后，通过注射端口注入造影剂以显影胆管系统。

随后，将收集的胆汁转移至预冷的15毫升离心管中，并置于冰上；若需后续保存，则在4°C条件下以500 × g离心10分钟，随后于-80°C冷冻保存。如需立即进行外泌体分离，取400微升胆汁转移至微量离心管中，在4°C条件下以300 × g离心10分钟，以收集细胞及细胞碎片。为进一步清除上清液，将溶液转移至新的微量离心管中，在4°C条件下以16,500 × g离心20分钟。

然后在生物安全柜中，将上清液收集到注射器中，并通过孔径为0.2微米的聚醚砜膜滤器过滤，以去除任何大于200纳米的残留颗粒。将过滤后的上清液转移至超速离心管中，并加入PBS使液体体积达到离心管容量的至少三分之二，以防止离心过程中离心管塌陷。在4°C条件下，以120,000 × g离心70分钟，沉淀外泌体。

微小的黄色沉淀物将包含外泌体。小心倾倒弃去上清液，并通过加入漂白剂至终浓度为10%（体积比体积）对废液进行消毒处理，然后静置20分钟。

对于后续实验，可将沉淀物在少量适当的溶液中直接处理，或重悬于 50 至 100 微升的 PBS 中，于 -80 摄氏度保存以备后续使用。根据文本方案制备经染色对比的细胞外囊泡（EVs）载网后，使用电子显微镜在 80 千伏加速电压下成像，起始放大倍数为 20,000 X，检测颗粒大小时逐步增加至 100,000 X。外泌体体积过小，无法通过常规显微镜或流式细胞术检测；然而，本图展示了一次典型的外泌体纳米颗粒追踪分析（NTA）结果，该分析测量了外泌体的浓度和粒径分布，在此分离自人胆汁的样本中，平均粒径为 97 纳米。

电子显微镜也可用于确认人胆汁中分离颗粒的大小，本图展示了一例典型的透射电镜结果。这些蛋白质印迹检测了在外泌体中富集的蛋白质，如四跨膜蛋白CD63和Tsg101。该实时扩增曲线图显示了从人胆汁外泌体中提取的多种microRNA物种。

由于外泌体缺乏像18S或28S核糖体RNA或看家基因这样可靠的标准化指标，加入合成的微小RNA（microRNA）进行标准化处理显得尤为重要。如果操作得当，外泌体分离技术可在三小时内完成。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从患者或动物体内获取胆汁，并对其进行处理以分离和分析细胞外囊泡。

在重复此操作步骤时，若无法立即进行超速离心，则务必记住在零下80摄氏度冷冻前，先将样本在500 × g、4摄氏度条件下离心。完成此步骤后，可进一步开展其他方法，例如微小RNA（microRNA）研究，以回答更多科学问题，如microRNA表达谱分析。请注意，胆汁操作可能具有极高危险性，因其可能含有肝炎病毒，因此在执行该操作时，必须始终采取预防措施，例如佩戴手套和护目镜。

该技术建立后，为胆管癌研究领域开辟了道路，推动了对细胞外囊泡作为胆汁中潜在生物标志物的研究，特别是在患有胆道问题（如PSA梗阻）的患者中。