利用纳米等离子体增强散射与低倍显微镜成像定量肿瘤来源的外泌体

纳米等离子体增强散射（nPES）是一种简单且非侵入性的方法，可替代手术活检，无需耗时且劳动密集的外泌体纯化步骤，从而将外泌体分析拓展至临床应用。该nPES检测法是一种快速分析外泌体外膜上特定生物标志物的方法，无需单独的分离和纯化步骤。本检测仅需极少量的临床样本即可完成。

因此，该方法可拓展nPES在基因工程小鼠模型或PDX小鼠模型研究中的应用。本实验方案中某些步骤可能看似困难，但经过数次练习后，任何具备基本湿实验技能的人员均可掌握并成功完成nPES操作。

开始实验操作时，将40 µL NeutrAvidin功能化的金纳米棒悬浮液与200 µL冰冷的pH 7磷酸盐缓冲盐水混合。在4 °C条件下以8500 ×g离心10分钟，弃去上清液。重复此洗涤步骤两次，然后将纳米棒重新悬浮于40 µL冰冷的PBS中。

接下来，向悬浮液中加入150 µL冷的PBS和10 µL浓度为0.5 mg/mL的相应生物素化抗体溶液。在4 °C条件下混合反应2小时，以获得抗体偶联的金纳米棒。使用200 µL冷PBS分三次洗涤纳米棒，每次在4 °C、6500 ×g条件下离心10分钟。

随后，将洗涤后的抗体偶联纳米棒重悬于 200 微升预冷的 PBS 中，并在 4 摄氏度保存不超过 24 小时。开始制备载玻片时，将所需的外泌体捕获抗体用 PBS 稀释至 0.25 毫克/毫升。取 1 微升该溶液加入经蛋白 A/G 处理并以光学级玻璃为背衬的载玻片的每个孔中。

然后将玻片转移至湿盒中，以确保孵育过程中反应孔不会干燥。在37摄氏度孵育一小时，使捕获抗体固定。随后吸去残留溶液，以去除未结合的抗体。

用移液枪向各孔加入一微升 PBS，随后吸出，重复三次以洗涤各孔。接着，迅速向每个孔中加入一微升基于 PBS 的封闭缓冲液，并将玻片在 37 摄氏度下孵育两小时。当处理约 15 个样本时，必须使用单通道移液器在五分钟内将封闭缓冲液加入 120 个孔中，以避免封闭剂蒸发。

在载玻片封闭的同时开始制备抗体偶联的金纳米棒溶液。封闭结束前约30分钟，将血浆或血清样本在室温水浴中快速解冻。解冻后涡旋振荡样本30秒，以确保悬浮液均匀。

然后，以500 × g离心15分钟，使蛋白质聚集体及其他碎片沉淀。取上清液10 µL等分至新管中，并用PBS进行1:1稀释。根据需要，通过轻柔涡旋或颠倒混匀稀释后的样品。

封阻结束后，吸去封阻缓冲液，并用 PBS 每次一微升，洗涤孔板三次。立即每孔加入一微升样品，每个样品设八个复孔。以相同方式将外泌体标准品加入相应的孔中。

将载玻片置于4摄氏度冰箱中孵育12至18小时。然后吸去各孔液体，每孔用1 µL PBS洗涤一次。向每孔加入1 µL抗体偶联的金纳米棒悬浮液，并将载玻片在37摄氏度孵育2小时。

随后，吸除纳米棒悬浮液，并在含有1%聚山梨酯20的磷酸盐缓冲液（PBS）中使用混匀仪清洗载玻片10分钟。然后吸去孔内液体，再将载玻片置于去离子水中，在旋转混匀仪上清洗10分钟。移除水后，将载玻片置于洁净的培养皿中自然晾干，随后将载玻片转移至暗场显微镜下观察。

使用配备暗场油浸聚光镜、4倍物镜和电动载物台的倒置显微镜。通过数字相机将显微镜连接至计算机，并打开成像软件。然后将样本玻片倒置放置在显微镜载物台上，并在聚光镜镜头接触玻片的位置滴加少量浸油。

在成像软件中显示显微镜下的视野。针对高浓度标准孔调整曝光时间，以确保图像不会过饱和。然后，打开大图像扫描工具，并将物镜放大倍数设置为10倍。

选择在载物台移动期间关闭快门，并在每次采集前等待 20 毫秒。将拼接重叠率设置为 20%，并选择通过最优路径进行拼接。选择通过扫描生成一幅大图像。

在扫描开始时将相机设置为手动对焦，并启用每20个视野自动逐步对焦。然后，选择设定目标扫描区域的左、右、上、下边界，并通过移动显微镜载物台至各个期望的边界位置来定义扫描区域。接下来，调节焦距、聚光镜和区域照明，以获得清晰且光照充足的图像。

命名要创建的图像文件，然后开始扫描。扫描完成后，打开图像并以 1/8 比例保存。打开图像分析软件。

然后，打开插件菜单，点击 DSM 扫描，定义列数和行数，将缩放百分比设置为 25，将点直径（以像素为单位）设置为 190 至 200，直径范围设置为 32，增量直径（以像素为单位）设置为 8。将 DSM 的低值和高值限制分别设置为 0 和 62，相邻距离设置为 100，减法偏置设置为 0。运行 DSM 算法，并保存生成的数据。

DSM 分析技术在 PANC-1 外泌体样本系列稀释浓度（从每微升 0.24 至 1.2 微克）范围内表现出良好的可重复性。金纳米棒的散射信号与外泌体蛋白浓度之间呈现出强烈的线性相关性。在胰腺癌患者与健康个体之间，表达癌症相关生物标志物 EphA2 的血清外泌体丰度存在显著差异。

从加入封闭剂开始，快速而准确的移液操作至关重要，以避免样品蒸发、引入交叉污染以及划伤载玻片表面。完成此步骤后，我们进行统计分析，以探究所关注的外泌体生物标志物的表达水平与所研究疾病不同阶段之间是否存在相关性。在建立该技术后，我们能够发现胰腺癌早期的外泌体生物标志物。

目前，我们正在将这一发现拓展至其他类型的癌症和感染性疾病。本实验所处理的样本通常为患者样本或来自癌细胞系的纯化外泌体样本，这些样本的操作需要经过特殊的安全培训。