基于CRISPR-Cas9的竞争性筛选实验探究基因依赖性

本视频将演示一种利用CRISPR-Cas9系统结合基于流式细胞术的竞争性生长实验，平行研究急性髓系白血病（AML）中多个候选基因的简便方法。该技术的主要优势在于快速且可扩展。演示该实验步骤的是本实验室的博士后Bo Rui Chen。

使用基于网络的 CRISPR 设计软件为感兴趣基因设计四到六个单导向 RNA。首先，在带星号的字段中填写相应信息，然后选择单导向 RNA 设计的靶基因组。

将目标序列粘贴到序列框中，然后点击提交按钮。为了在所需的单导向RNA表达质粒中进行克隆，请在正义寡核苷酸的5'端添加核苷酸CACC，在反向互补的反义寡核苷酸的5'端添加AAAC。随后向公司订购预混的正义与反义寡核苷酸，以96孔板形式提供，标记为Oligo Mix。

另取一个单独的U型底96孔板，标记为退火板。为每孔退火反应配制预混液：每份包含1微升T4多聚核苷酸激酶、1微升10×T4 DNA连接酶缓冲液以及6微升水。向退火板的每个孔中加入8微升上述预混液，随后加入2微升预先混合好的正义链与反义链寡核苷酸。

轻轻吹打混匀两到三次，然后短暂离心使混合液沉至孔底。在PCR仪中使用以下退火程序：37摄氏度孵育30分钟，95摄氏度变性2分30秒，随后以每秒0.1摄氏度的速率缓慢冷却至22摄氏度。

退火完成后，准备一个新的96孔板，标记为“稀释寡核苷酸混合物”，将退火反应中磷酸化并已退火的寡核苷酸用水稀释1:200。使用适当的缓冲液，在37摄氏度条件下孵育2小时，加入1.5微升BBS1限制性内切酶消化5微克单导向RNA表达载体，使其线性化。接着，取一个新的标记为“连接板”的96孔板，向每个目标单导向RNA连接反应对应的孔中加入20纳克经BBS1消化的单导向RNA表达载体。

向其中加入 2 µL 来自稀释后 Oligo Mix 板的磷酸化退火寡核苷酸。每孔加入 1 µL 10X T4 连接酶缓冲液和 1 µL T4 连接酶酶液，轻轻吹打混匀。将板在室温下孵育两小时。

在连接反应结束前约10分钟，将90微升感受态大肠杆菌细胞置于冰上。将感受态细胞分别转移10微升至另一块96孔板的各个孔中。将连接反应混合物加入含有感受态细胞的各孔中。

轻轻吹打混匀，在室温下孵育10分钟。从每种转化反应中吸取五微升细菌DNA混合物，直接加入含有含100毫克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂的6孔板中的一个孔内。向每个孔中加入约5至8颗玻璃珠，将6孔板以圆形轨迹振荡8至10次。

将培养皿在37摄氏度下孵育过夜。次日，用无菌的20微升移液器吸头从每个孔中挑取一至两个单菌落，并在含有LB琼脂和100毫克/毫升氨苄青霉素的无菌10厘米培养皿上标记好的位置划线接种。在LB平板上划线后，将吸头弹入标记有相应细菌克隆编号的14毫升圆底管中的3毫升氨苄青霉素培养基内。随后，将细菌平板直接送去做Sanger测序。

在确认克隆的单导向RNA序列后，使用质粒小提试剂盒，按照制造商的说明从相应的14毫升离心管中纯化DNA。慢病毒单导向RNA颗粒的制备采用96孔板格式，具体步骤如文本方案所述。病毒上清液立即于-80摄氏度冷冻保存。

在将单导向RNA转导至AML Cas9细胞的前一天，使用10微克/毫升浓度的重组人纤维连接蛋白片段对平底非组织培养处理的96孔板进行包被，每孔加入100微升。用保鲜膜包裹该板以防止蒸发损失，并在室温下放置过夜。次日，从96孔板的每个孔中移除重组人纤维连接蛋白片段。

将每种单链向导RNA的病毒上清液在室温下解冻。从每根试管中取50 µL病毒上清液，分别加入转导板的每个包被孔中。用保鲜膜包裹培养板，以避免离心过程中可能发生的污染。

在35摄氏度下，以1,300 ×g离心90分钟。在离心感染接近结束时，从培养瓶中计数高表达Cas9的克隆B3细胞。计数后，将所需数量的细胞离心沉淀，并重悬于新鲜培养基中。

90分钟的离心感染后，将培养板倾斜，使用调整至50微升的多通道移液器缓慢吸出所有孔中的上清液。随后，沿孔壁缓缓加入100微升B3细胞克隆的培养物。在35摄氏度下以1,300 ×g离心2分钟，使细胞沉降至孔底。

将培养板转移至37摄氏度的组织培养级孵育箱中。次日，向每孔含有单导向RNA转导细胞的孔中加入100微升新鲜培养基，使最终培养基体积达到200微升。然后将培养板放回孵育箱中。

转导后72小时，通过流式细胞术检测每个孔中含单链引导RNA的BFP阳性细胞百分比。使用细胞活力染料标记并排除死细胞，以进行分析。每次检测分析后，将部分细胞继续传代至含新鲜培养基的新孔中，以避免在实验过程中细胞过度生长。

每两到三天重复一次流式细胞术分析，以检测BFP阳性细胞相对于BFP阴性细胞的比例。使用流式细胞术分析软件，分析每个时间点BFP阳性细胞的百分比。竞争性增殖实验成功的关键在于采用恰当的设门技术，以确保最终活细胞数量的准确性。

将每个样本的 FCS 文件拖入软件中。双击任意一个样本文件，绘制前向散射光（x 轴）与侧向散射光（y 轴）的散点图。圈选所有细胞。

双击已圈选的细胞，在 y 轴上绘制活率染料信号，x 轴为前向散射光高度或面积点图，圈选活率染料阴性的细胞。双击已圈选的活细胞，在 y 轴上绘制 BFP 信号，x 轴为前向散射光信号点图。

圈选BFP阳性细胞。通过在“分组”选项卡下将选定样本的门控拖拽至所有样本，将门控应用于全部样本。点击表格编辑器，为所有样本创建分析表格。

将一个样本中BFP阳性细胞计数拖入表格，在表格编辑器中点击显示按钮，生成所有样本的批量报告，表格中显示BFP阳性细胞的百分比。将表格保存为Excel文件。该系统被用于研究可能在人和小鼠急性髓系白血病（AML）细胞系增殖或存活中发挥作用的基因。

使用两种不同的单导向RNA靶向AAVS1安全港位点，对人MOM13 Cas9细胞的增殖无影响。相比之下，当靶向与DNA复制相关的基因RPA3时，与未转导的BFP阴性细胞相比，BFP阳性细胞的比例出现渐进且显著的下降。类似地，在小鼠MLL-AF9 Cas9细胞中检测了靶向表观遗传调控因子Dot1l和眼色素基因Rhodopsin的单导向RNA的作用。结果显示，靶向Dot1l的单导向RNA与靶向Rhodopsin的单导向RNA相比，表现出显著且渐进的竞争性增殖抑制效应。

这些结果表明，表达 MLL-AF9 的大量白血病细胞对 Dot1l 的缺失具有敏感性，证实了先前已发表的研究结果。假设每个基因使用四到六个引导 RNA，该方法非常适合并行检测至少 16 至 24 个基因，也可应用于任何癌细胞系中基因依赖性的检测。当涉及更多数量的基因时，例如需要在急性髓系白血病（AML）细胞中检测整个分子通路的情况，基于 CRISPR-Cas9 文库筛选的方法将更为适用。