基于尺寸排阻色谱法分离细菌胞外囊泡：一种根据尺寸分离革兰氏阴性菌外膜囊泡异质群体的技术 尺寸排阻色谱法，细菌胞外囊泡，外膜囊泡，革兰氏阴性菌，囊泡分离，尺寸分离，纳米颗粒，生物分离技术

在适宜的培养条件下，革兰氏阴性细菌会向培养上清液中释放携带货物的外膜囊泡（OMVs）。这些囊泡大小不均，呈微小的球形结构，可介导细胞间通讯。

为了分离不同大小的OMV亚群，取一个底部带有适当滤膜以支撑基质的空排阻色谱柱。

使用由化学惰性、具有特定孔径的球形珠粒组成的凝胶过滤介质装填层析柱，确保孔径大小能够有效排除大尺寸的外膜囊泡（OMVs）进入珠粒内部。用适当的缓冲液平衡层析柱，防止珠粒干燥，以实现最佳纯化效果。

将含有不同大小亚群的外膜囊泡（OMVs）、蛋白质聚集体和核酸的细菌培养上清液加在柱的顶部。让样品在重力作用下自然流过。

当样品流经层析柱时，较大的外膜囊泡（OMV）因无法进入凝胶珠的孔隙，只能通过凝胶珠之间的间隙流动，从而首先被洗脱出来。与此同时，较小的外膜囊泡可进入基质孔隙，经过更长的路径，随后被洗脱。

由于体积较小，蛋白质聚集体和核酸会进入基质中的各种孔隙，导致它们在柱中保留时间最长，并作为最后的组分被洗脱出来。分别收集不同的OMV洗脱液，并储存以供后续分析。

首先，使用玻璃棒混匀一管凝胶过滤介质，将足以填满层析柱并额外多出约50%的体积倒入玻璃瓶中。静置使凝胶珠沉降，倾去上清液。用洗脱缓冲液重悬凝胶珠，制成终浓度约为70%凝胶和30%缓冲液的溶液，并在真空条件下对溶液进行脱气处理。

将层析柱垂直固定在铁架台上，先用洗脱缓冲液充满层析柱以润湿柱壁，然后排出缓冲液至仅剩约1厘米高。接着，小心地用移液器将凝胶珠加入层析柱中，同时持续排出多余缓冲液，防止凝胶珠沉降，直至凝胶柱床高度距柱上样储液区底部约2厘米为止。

上样前，在真空条件下对洗脱缓冲液进行脱气处理。用约两倍柱体积的洗脱缓冲液冲洗层析柱。当缓冲液流至凝胶层顶端时，小心地将2毫升浓度为100至200纳摩尔每升的外膜囊泡样品加在凝胶层上方，避免扰动凝胶表面，并让样品进入凝胶。

缓慢将洗脱缓冲液加入柱子中，注意不要扰动凝胶层，并在柱子下方放置一个 50 毫升的离心管。为防止柱子干燥，需同时向柱子顶部添加洗脱缓冲液。

收集20毫升洗脱液后，将一排1.5毫升离心管置于层析柱下方，每管收集1毫升洗脱液，共收集96个组分。在收集样品的同时，持续向层析柱中添加洗脱缓冲液。清洗层析柱时，先让1个柱体积的0.1摩尔氢氧化钠溶液流经层析柱，随后再用2个柱体积的洗脱缓冲液冲洗。