蓝细菌胞外囊泡的分离与表征

本方案具有重要意义，因为它不仅展示了从不同规模的培养物中纯化囊泡的方法、各种方法之间的权衡与差异，还涉及了野外样品处理时的注意事项。蓝细菌在囊泡取样与分析方面带来了独特的挑战。这些技术已成功地从培养物及环境样品中分离并富集了囊泡。

对于体积小于500毫升的样品浓缩，首先使用1类超纯水冲洗15至20毫升的超滤离心浓缩管。将浓缩管放入离心机中，在4°C条件下以4,400 × g离心。弃去滤过液，并至少重复此步骤两次。

将上清液样品加入经水冲洗的浓缩管中，在相同条件下离心。重复此步骤，直至样品浓缩至终体积为15至30毫升。若需浓缩超过500毫升的体积，应按照文中所述方法搭建装置，进行切向流过滤。

将蠕动泵连接至进样管路，并在回流管路上安装可调节夹具。按照文中的描述对切向流过滤系统进行消毒，然后用一升一级超纯水冲洗装置。向样品储液器中加入孔径小于0.2微米的滤液。

缓慢提高截留液管路的泵速和回压水平，以增加滤过液管路的产出量。继续运行切向流过滤，并在物料被移除时，向储液槽中补充培养上清液。当储液槽中的体积达到维持进液管路流动且不引入气泡所需的最小体积时，停止浓缩样品。

用夹子关闭流出管路。移除截留液管路上的背压。将浓缩的上清液以每分钟20至40毫升的循环速率通过滤器再循环10分钟，以最大化回收率。

将截留液转移至一个洁净的容器中，将进样管从样品中取出，并收集浓缩后的物质。使用移液器回收样品储液器中残留的任何物质。通过0.2微米的一次性注射器滤器过滤浓缩后的上清液。

如有需要，可将最终浓缩物在4°C下保存约三周，然后再进行囊泡纯化。为沉淀浓缩的培养样品，将其放入洁净的超速离心管中，并加入洁净的培养基或缓冲液，确保管子充满。离心后，用移液器吸除上清液。

用新鲜的培养基或洗涤缓冲液（如1×磷酸盐缓冲液）重新洗涤沉淀物，并重复离心步骤。使用1毫升移液器轻轻吹打，将最终沉淀物重悬于新鲜培养基中，然后转移至洁净容器。如需进行密度梯度超速离心，按文中所述方法配制碘克沙醇储备液。

将1份4X缓冲液与3份60%碘克沙醇储备液混合，配制成45%碘克沙醇溶液。用1X缓冲液将45%碘克沙醇稀释，制备出终浓度分别为40%、35%、30%、25%、20%、15%和10%的梯度介质储备液。然后，小心地将等量的上述各浓度碘克沙醇梯度储备液依次叠加至超速离心管中，充分利用整个离心管的容积。

离心后，使用移液器小心吸取或使用组分收集器，将约4.5毫升的梯度液分成每份0.5毫升的组分。使用分析天平和校准过的移液器测定每份组分的密度，单位为克/毫升。将样品从离心管中取出，称量其质量，然后将样品重新放回离心管中。

将各个组分用新离心管中的洁净缓冲液稀释，随后进行洁净培养基或缓冲液洗涤。小心加入五微升囊泡，静置五分钟。通过将网格边缘接触一张洁净滤纸来移除样品。

用移液器吸取 20 至 50 微升 2% 醋酸铀酰溶液，滴加到覆盖有塑料膜的平坦表面上。然后将载网漂浮于液滴表面染色 2 分钟。用滤纸吸去醋酸铀酰溶液，再将载网在超纯水滴上短暂漂浮以洗涤。

使用洁净的注射器将超纯水注入腔室，并确保无气泡产生。点击“start camera”以查看腔室中拇指印周围的最佳区域。将“screen gain”和“camera level”滑块调至最大，然后逐渐降低至最低水平，以观察最微弱的颗粒。

根据需要调整焦距，确保视野中颗粒大致均匀可见，并继续用超纯水冲洗，直至腔室清洁。使用1毫升注射器将囊泡样品加入腔室，并确认采集参数。在SOP下拉菜单中选择“标准测量”，并调整设置，以采集至少三次技术重复，每次录制60秒视频。

按下“create and run script”，按照提示操作，并在各重复样本之间向腔室推入约100微升样品。通过点击“analysis”和“open experiment”来确定颗粒参数，并加载样品文件。选择“process selected files”，等待分析完成。

从集胞藻（Synechocystis sp. PCC6803）中分离和表征细胞外囊泡的结果显示，其外膜含有类胡萝卜素，使得通过超速离心直接沉淀收集的囊泡样品呈现特征性的橙色。将重悬的囊泡沉淀通过透射电子显微镜进行检测，可采用醋酸铀酰对样品进行负染色，或观察超薄切片。

使用动态光散射和纳米颗粒追踪分析评估囊泡的大小分布和浓度。将纯化的集胞藻属 sp. PCC6803 囊泡在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并对脂多糖进行染色。

应在浓缩囊泡样品前后分别取样，以确保切向流过滤系统正常工作，并确认囊泡正在被浓缩。随后需使用纳米颗粒跟踪分析技术对两个样品进行测量。未来还需将此方法与其他技术（如尺寸排阻色谱法或不对称场流分离法）相结合，以提高从培养物和环境样品中区分和分离小颗粒的能力。

该技术有助于研究蓝细菌囊泡及其在蓝细菌生物学中的特定功能作用。