可扩展的细胞外囊泡分离与纯化方法 大肠杆菌 及其他细菌

本方案的重要性在于，它提供了一种高度可重复的方法，用于从多种细菌中分离出细胞外囊泡。该技术的优势在于，可从规模较大的细菌培养环境中分离EVs，从而为体内研究创造条件。尽管我们展示的数据反映的是临床前应用，但可以预见，本方案有望被改进并用于治疗用细菌EVs的生产制造。

该方法经过少量修改后可应用于任何可放大的细胞培养系统。由于该方案具有可扩展性，因此必须配备合适尺寸的滤器和尺寸排阻色谱柱，以处理所需起始体积的细菌培养物。演示实验操作的人员包括：贾斯汀·拉西亚（Justin Lathia）博士实验室的助理技术员萨迪·约翰逊（Sadie Johnson）、贾斯汀·拉西亚（Justin Lathia）博士实验室的肿瘤学研究员狄奥尼修斯·沃森（Dionysius Watson），以及我实验室的研究技术员阿基姆·桑托斯（Akeem Santos）。

使用无菌接种环将大肠杆菌的单菌落接种于250至1000毫升的Luria-Bertani（LB）液体培养基中。随后，将培养物置于摇床培养箱中，在300转/分钟、37°C条件下进行好氧培养。培养48小时后，将菌液转移至洁净的500毫升聚丙烯离心管中，于4°C、5,000 × g条件下，使用大容量固定角转子离心机离心15分钟，以澄清细菌培养液。

将上清液小心倾倒入干净的离心管中，于10,000 × g离心15分钟。随后，将上清液转移至适当大小的0.2微米聚醚砜真空驱动滤器装置，并将过滤装置连接至真空壁式供气系统。若过滤速度显著下降，需将未过滤的样品转移至新的过滤装置中。

过滤后的培养基可在4°C下保存过夜，或立即进行后续处理。为检测活细胞是否完全去除，取一份过滤后的上清液涂布于合适的琼脂平板上，在该细菌菌株的最佳培养条件下孵育后，确认无任何菌落生长。对于体积为100毫升的过滤培养基，将其90毫升加入截留分子量为100千道尔顿的离心超滤装置的储液室中，于4°C条件下，使用摆桶转子以2,000 × g离心15至30分钟为一个区间，重复操作直至储液室中的液体体积浓缩至小于0.5毫升。

为补充储液池中剩余的过滤培养基，需移除装置底部的流穿液以重新平衡。若储液池中浓缩培养基的黏度明显增加，可用 PBS 稀释培养基，再通过离心重新浓缩，以去除分子量低于 100 千道尔顿的非细胞外囊泡（EV）蛋白。随后，将浓缩后的培养基转移至低蛋白结合管中，在 4 摄氏度下过夜保存。对于体积超过 100 毫升的过滤培养基的浓缩，应选择合适尺寸、分子量截留值为 100 千道尔顿的切向流过滤（TFF）装置。

按照文稿中所述组装过滤系统后，将200毫升PBS泵入量筒，以确定与目标流速相对应的合适泵速。设定泵速后，在室温下以约200毫升/分钟的速度循环过滤后的条件培养基，并收集穿过超滤膜、分子量小于100千道尔顿的组分作为废液，置于另一容器中，直至条件培养基体积减少至100至200毫升。随后，用PBS将过滤后的液体体积依次进行两倍稀释，并继续在较小容器中通过泵循环培养基，逐步将体积浓缩至75至100毫升，然后进一步浓缩至25毫升和10毫升。

将进样管从样品储液槽中取出，并通过泵冲洗滤膜以最大限度回收样品。将浓缩后的样品转移至分子截留量为100千道尔顿的15毫升离心超滤装置中，在4°C条件下，使用水平转子以2,000 × g离心15至30分钟，重复此步骤直至上层储液槽中的液体体积小于2毫升。将浓缩后的培养基转移至低蛋白吸附管中，于4°C下过夜保存。

为了分离细胞外囊泡（EVs），使用尺寸排阻色谱法（SEC）。当起始材料体积小于100毫升时，采用床体积为10毫升的小型色谱柱；当起始材料体积大于100毫升时，则使用床体积为47毫升的较大色谱柱。在实验开始前数小时内，将SEC色谱柱和磷酸盐缓冲液（PBS）恢复至室温，随后使用标准实验室支架和夹具将色谱柱固定于垂直位置。在连接SEC色谱柱之前，先让5毫升PBS流经滤芯进入废液容器，以润湿样品储液室。

然后，拧开色谱柱的入口盖，在样品储液槽中加入 2 毫升 PBS，并在 PBS 通过烧结滤板滴出时，小心地将储液槽连接到色谱柱上。为平衡色谱柱，向样品储液槽中加入 47 毫升 PBS，随后打开 SEC 色谱柱底部的盖子。接着，使所有上样的缓冲液流经色谱柱，并弃去流出液。

将两毫升样品加入样品储液室后，让样品完全进入层析柱，并收集穿流液。立即向样品储液室中加入体积为14.25毫升减去样品体积的PBS，使溶液流经层析柱，同时弃去相当于层析柱空体积的流出液。随后，将一个两毫升低吸附微量离心管置于SEC层析柱正下方，待两毫升PBS流经层析柱后，收集最初的穿流液，即第一组分。

继续向样本储液池中加入两毫升 PBS，以收集后续每一份组分。将收集的组分在4摄氏度下短期保存，或在负80摄氏度下长期保存。对于所收集EV组分的无菌检测，取100微升待用组分接种于三毫升培养基中进行检测。

然后，在最佳条件下培养培养基，并观察浑浊度至少三天。或者，可将组分样品接种于含有用于培养产菌细菌的培养基的琼脂平板上，随后检查菌落形成情况。接下来，将单个或混合组分的25%至50%转移至低蛋白结合管中，在-80摄氏度条件下保存，以避免冻融循环。

代表性分析显示大肠杆菌MP1的细胞外囊泡（EVs）在层析早期组分中被洗脱出来。第1至第6组分含有最多的EVs，其平均直径小于100纳米。同时，后续组分中仅含有无EV的蛋白质及极少量EVs。

通过透射电子显微镜确认了细胞外囊泡（EV）的富集情况及其大小，尤其在第2至第6组分中得到证实。观察发现，富含EV的第2至第7组分具有较高的纳米荧光素酶活性，但与后续组分相比，非EV相关的mCherry荧光信号极低。免疫胶体金标记证实了纳米荧光素酶在第2至第5组分中与EV相关联。

通过从多种厌氧细菌的培养物中分离EVs，评估了该方案对其他细菌种类的适用性。观察发现，早期层析组分（组分一至四）富含直径小于100纳米的EVs。复杂的脑心浸液（BHI）中所含EV尺寸的颗粒占总EV产量的比例低于25%。

使用能够处理细菌培养液起始体积的切向流过滤装置非常重要。该技术使我们能够获得足够的细胞外囊泡，以在复杂的动物模型中研究其生物学功能。